內(nèi)皮素-1、NF-κB及AP-1在高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞表達(dá)纖維連接蛋白中的作用.pdf

1、糖尿病腎病(diabeticnephropathy,DN)是一種主要的糖尿病(diabetesmellitus，DM)微血管并發(fā)癥，它是遺傳因素與長(zhǎng)期高血糖等環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，是DM常見(jiàn)和嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，其特征性的病理變化為腎小球基底膜增厚、系膜細(xì)胞肥大增生、細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix，ECM)積聚增加及腎小球硬化，導(dǎo)致這些特征性病理變化的機(jī)制尚不完全清楚。內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-

2、1)是一種具有很強(qiáng)血管活性的細(xì)胞因子，近年來(lái)成為研究DN發(fā)病機(jī)制中的熱點(diǎn)之一。ET-1具有廣泛的組織分布和生物學(xué)作用，在一些研究中證實(shí)可以促進(jìn)纖維連接蛋白(fibronectin,FN)的表達(dá)。NF-κB、AP-1作為具有多向性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)而介導(dǎo)機(jī)體的多種病理生理過(guò)程。有研究證實(shí)，ET-1、NF-κB和AP-1參與調(diào)控高葡萄糖(highglucose,HG)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1和ECM表達(dá)增加。在

3、體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(glomerularmesangialcell，GMC)中，ET-1、NF-κB和AP-1是否也參與調(diào)控高葡萄糖誘導(dǎo)的ECM表達(dá)尚不清楚。 本研究用體外培養(yǎng)的大鼠GMC，探討高葡萄糖對(duì)其ET-1及FNmRNA及蛋白表達(dá)的影響以及ET-1受體拮抗劑PD142893，NF-κB抑制劑PDTC及JNK抑制劑SP600125在GMC表達(dá)ET-1及FN中的作用，從而探討ET-1、NF-κB及AP-1在高葡萄糖

4、誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞ECM表達(dá)中的作用及可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為尋求新的DN防治靶目標(biāo)提供理論依據(jù)。 1.高濃度葡萄糖對(duì)大鼠GMC增殖的影響 我們首先觀察了正常濃度葡萄糖(D-glucose，5.6mmol/L)、高濃度葡萄糖(D-glucose，30.0mmol/L)及高滲透壓(D-glucose，5.6mmol/L+D-mannitol，24.4mmol/L)三種不同的培養(yǎng)條件對(duì)大鼠GMC增殖的影響。顯微鏡下觀察到

5、HG組MC1097體外培養(yǎng)達(dá)到完全融合時(shí)所需時(shí)間較NG組延長(zhǎng)，MTT法測(cè)得NG組OD570為0.73±0.18，HG組OD570為0.57±0.10，與NG組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)；OC組OD570為0.62±0.13，與NG組和HG組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。結(jié)果提示高濃度葡萄糖可以顯著抑制大鼠GMC增殖，高滲透壓也可以抑制大鼠GMC增殖，但作用不如高濃度葡萄糖顯著。 2.高濃度葡萄糖對(duì)培養(yǎng)大

6、鼠GMC表達(dá)ET-1和FN的時(shí)間過(guò)程。 為了確定培養(yǎng)時(shí)間對(duì)大鼠GMC表達(dá)ET-1和FN的影響以及本研究中大鼠GMC體外培養(yǎng)的合適時(shí)間，我們?cè)趍RNA及蛋白水平檢測(cè)高濃度葡萄糖培養(yǎng)條件下，大鼠GMC表達(dá)ET-1和FN的時(shí)間過(guò)程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高糖條件下培養(yǎng)0h、12h、24h、36h及48h后，ET-1mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為100、154.8±9.1、181.8±9.5、200.6±20.3和213.9±28.6，蛋白表達(dá)分別為(2

7、3.1±6.1)pg/mL、(39.7±5.7)pg/mL、(56.3±7.0)pg/mL、(65.5±8.4)pg/mL和(69.2±5.5)pg/mL；FN的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為100、153.3±9.1、198.2±6.8、217.4±7.8和232.6±7.6，蛋白表達(dá)分別為(33.9±3.1)ng/mL、(57.5±5.0)ng/mL、(76.2±6.4)ng/mL、(84.7±5.7)ng/mL和(94.9±7.3)ng

8、/mL。與0h比較，高糖培養(yǎng)24h后ET-1mRNA和蛋白水平表達(dá)分別增加81％及144％(p＜0.01)，F(xiàn)NmRNA和蛋白水平表達(dá)分別增加98％及125％(p＜0.01)。結(jié)果提示高濃度葡萄糖培養(yǎng)條件下，大鼠GMC表達(dá)ET-1和FN呈時(shí)間依賴性。24h可以作為本研究中大鼠GMC體外培養(yǎng)的合適時(shí)間。 3.高濃度葡萄糖及ET-1對(duì)大鼠GMC表達(dá)FN的作用 我們用RT-PCR法及ELISA法分別在mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)

9、高濃度葡萄糖及ET-1對(duì)大鼠GMC表達(dá)FN的作用。研究發(fā)現(xiàn)，HG組與NG組比較，ET-1在mRNA水平表達(dá)增加77％(p＜0.01)，蛋白水平表達(dá)由(21.6±3.1)pg/mL增至(59.6±5.2)pg/mL(p＜0.01)；FN在mRNA水平的表達(dá)增加74％(p＜0.01)，蛋白水平表達(dá)由(32.4±4.6)ng/mL增加至(86.5±12.7)ng/mL(p＜0.01)。NG組加入ET-1(5nmol/L)后，F(xiàn)N在mRNA水平

10、表達(dá)增加143％(p＜0.01)，蛋白水平表達(dá)由(32.4±4.6)ng/mL增加至(79.1±11.6)ng/mL(p＜0.01)。加入ET-1受體拮抗劑PD142893(10μmol/L)后，高糖誘導(dǎo)的FN表達(dá)在mRNA水平被抑制35％(p＜0.01)，蛋白水平表達(dá)由(86.5±12.7)ng/mL降至(35.0±7.4)ng/mL(p＜0.01)；ET-1誘導(dǎo)的FN表達(dá)在mRNA水平被抑制52％(p＜0.01)，蛋白水平表達(dá)由(7

11、9.1±11.6)ng/mL降至(36.1±6.6)ng/mL(p＜0.01)。結(jié)果說(shuō)明，在體外培養(yǎng)的大鼠GMC中，高濃度葡萄糖可以顯著增強(qiáng)ET-1和FN表達(dá)，同時(shí)，ET-1可以模擬高濃度葡萄糖的作用增強(qiáng)FN表達(dá)，高濃度葡萄糖和ET-1增強(qiáng)FN表達(dá)的作用可被ET受體拮抗劑所抑制。 4.NF-κB及AP-1在大鼠GMC表達(dá)ET-1及FN中的作用 我們?cè)隗w外培養(yǎng)的大鼠GMC中觀察NF-κB抑制劑PDTC(10μmol/L)及

12、JNK抑制劑SP600125(10μmol/L)對(duì)ET-1及FN表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，PDTC及SP600125對(duì)ET-1的表達(dá)無(wú)明顯影響(p＞0.05)。給予PDTC后，高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的FNmRNA表達(dá)可被抑制42％(p＜0.01)，蛋白表達(dá)水平由(86.5±12.7)ng/mL降至(34.2±2.9)ng/mL(p＜0.01)，ET-1誘導(dǎo)的FNmRNA表達(dá)可被抑制50％(p＜0.01)，蛋白表達(dá)水平由(79.1±11.6)ng/

13、mL降至(33.0±4.5)ng/mL(p＜0.01)；給予SP600125后，高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的FNmRNA表達(dá)可被抑制30％(p＜0.01)，蛋白表達(dá)水平由(86.5±12.7)ng/mL降至(34.0±6.3)ng/mL(p＜0.01)，ET-1誘導(dǎo)的FNmRNA表達(dá)可分別被抑制45％(p＜0.01)，蛋白表達(dá)水平由(79.1±11.6)ng/mL降至(37.0±3.2)ng/mL(p＜0.01)。結(jié)果說(shuō)明，在體外培養(yǎng)的大鼠GMC

14、，NF-κB、AP-1不參與調(diào)控高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的ET-1表達(dá)增加，但在高濃度葡萄糖和ET-1誘導(dǎo)的FN表達(dá)增加中發(fā)揮著重要作用。 結(jié)論：1.高濃度葡萄糖抑制大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖。高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮素-1和纖維連接蛋白的表達(dá)增加不是由細(xì)胞增殖引起。 2.高濃度葡萄糖增強(qiáng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)皮素-1和纖維連接蛋白的表達(dá)，且這種增強(qiáng)作用呈時(shí)間依賴性。 3.內(nèi)皮素-1可以模擬高濃度葡萄糖增強(qiáng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)纖維連接

15、蛋白的作用，高濃度葡萄糖和內(nèi)皮素-1增強(qiáng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)纖維連接蛋白的作用可以被內(nèi)皮素受體拮抗劑所抑制。提示高濃度葡萄糖增強(qiáng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)纖維連接蛋白的作用是通過(guò)內(nèi)皮素-1介導(dǎo)的 4.NF-κB抑制劑PDTC及JNK抑制劑SP600125不能抑制高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)皮素-1表達(dá)增加。但可以抑制高濃度葡萄糖和內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞纖維連接蛋白表達(dá)增加。提示在高濃度葡萄糖條件下培養(yǎng)的大鼠腎