腦外傷后Nrf2-ARE通路對(duì)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一部分:小鼠腦外傷模型中Nrf2-ARE通路對(duì)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的作用
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)主要目的為檢測(cè)TBI后Nrf2和UPS的表達(dá)，并進(jìn)一步觀察在使用UPS抑制劑MG132后小鼠的預(yù)后，探討兩者之間可能的調(diào)控機(jī)制。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:使用健康成年雄性ICR小鼠，大小約28-32g;成年雄性Nrf2(-/-)小鼠，大小約28-32g;均有南京軍區(qū)

2、南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供。
　　2.小鼠TBI模型的建立:采用改良的flierl自由落體法制備閉合性小鼠腦損傷模型。
　　3.藥物的處理:tBHQ先配制成濃度為5mg/ml溶于1％DMSO中的溶液，按照50mg/kg計(jì)算劑量并于造模前一天經(jīng)腹腔注射給藥。
　　4.標(biāo)本的取材和制備:致傷24小時(shí)后，將小鼠麻醉后，經(jīng)左心室灌注等滲鹽水(4℃)至肝臟發(fā)白后斷頭開顱取腦。
　　5.神經(jīng)功能評(píng)分:在TBI后1天，3天采用N

3、SS評(píng)分對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。所得分值越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。
　　6.測(cè)定腦水腫:TBI后24小時(shí)，將動(dòng)物處死，迅速取腦，去除腦干及小腦，獲得傷灶側(cè)皮層組織。
　　7.TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè):采用TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒對(duì)腦組織石蠟切片(5μm)進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)檢測(cè)。
　　8.western blot檢測(cè):分別利用12％，10％的凝膠電泳分離核蛋白，漿蛋白，檢測(cè)各組核蛋白，漿蛋白中Nrf2的表達(dá)。
　　

4、9.免疫組化染色:制作組織切片，利用免疫組化染色方法檢測(cè)各組中Nrf2的表達(dá)，及Nrf2在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。
　　10.凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn):采用EMSA試劑盒對(duì)小鼠腦皮層組織進(jìn)行生物素標(biāo)記的Nrf2目的DNA的檢測(cè)。
　　11.乙醇磷鎢酸電鏡觀察泛素化蛋白:外傷模型后24小時(shí)，取各組小鼠的腦組織約1mm3，置于4％戊二醛溶液中固定1小時(shí)。
　　12.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差

5、(x±SEM)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.TBI后激活Nrf2表達(dá)可以改善神經(jīng)功能，減少腦水腫和抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。
　　2.TBI激活Nrf2表達(dá)可減少異常的泛素化蛋白表達(dá)。
　　3.TBI后抑制Nrt2表達(dá)可加劇神經(jīng)功能障礙，增加腦水腫，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。
　　4.TBI后抑制Nrf2表達(dá)可增加異常的泛素化蛋白的表達(dá)。與單純外傷組相

6、比，Nrf2(-/-)小鼠在外傷后泛素化蛋白增多(P＜0.05），相對(duì)的游離泛素減少(P＜0.05)。
　　5.在Nrt2(+/+)小鼠中使用MG132后可顯著增加泛素化蛋白的表達(dá)，并且明顯加劇神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，而在Nrf2(-/-)小鼠中使用MG132后泛素化蛋白表達(dá)沒有明顯改變，并且不影響神經(jīng)細(xì)胞的凋亡水平。
　　結(jié)論:
　　1.TBI后激活Nrf2表達(dá)引起泛素化蛋白的減少，表明UPS活性增高;TBI后抑制Nrf2表

7、達(dá)引起泛素化蛋白的增加，表明UPS活性下降。
　　2.Nrf2可能通過調(diào)控UPS來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分:小鼠腦外傷模型中Nrf2-ARE通路調(diào)控泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的可能機(jī)制
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)通過激活或抑制Nr2表達(dá)來檢測(cè)GSH/ROS水平，同時(shí)通過激活或抑制GSH/ROS表達(dá)來檢測(cè)UPS活性的高低，探討Nrf2與UPS之間可能的調(diào)控機(jī)制。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:使用健康

8、成年雄性ICR小鼠，大小約28-32g;成年雄性Nrf2(-/-)小鼠，大小約28-32g;均有南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供。
　　2.小鼠TBI模型的建立:采用改良的flierl自由落體法制備閉合性小鼠腦損傷模型。
　　3.藥物的處理:tBHQ先配制成濃度為5mg/ml溶于1％DMSO中的溶液，按照50mg/kg計(jì)算劑量并于造模前一天經(jīng)腹腔注射給藥。
　　4.標(biāo)本的取材和制備:致傷24小時(shí)后，將小鼠麻醉后，經(jīng)左心

9、室灌注等滲鹽水(4℃)至肝臟發(fā)白后斷頭開顱取腦。
　　5.檢測(cè)腦組織中GSH和ROS含量:根據(jù)GSH和ROS檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)量，用Bradford法測(cè)定總蛋白。
　　6.免疫熒光化學(xué)檢測(cè):制備組織冰凍切片，利用免疫熒光雙染方法檢測(cè)腦組織中ROS的表達(dá)以及在神經(jīng)元細(xì)胞，細(xì)胞核中的分布情況。
　　7.western blot檢測(cè):利用8％凝膠電泳分離總蛋白，檢測(cè)總蛋白中泛素化蛋白的表達(dá)。
　

10、　8.免疫組織化學(xué)檢測(cè):制作石蠟組織切片，利用免疫組化染色方法檢測(cè)泛素化蛋白的表達(dá)。
　　9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SEM)表示。
　　結(jié)果:
　　1.TBI后使用tBHQ可以引起GSH含量增高，ROS表達(dá)強(qiáng)度下降。與單純外傷相比，TBI后使用tBHQ可以明顯增高GSH表達(dá)含量(P＜0.05)，而且ROS表達(dá)強(qiáng)度明顯變?nèi)?P＜0.0001)。
　　2.TBI

11、后Nrf2(-/-)小鼠中GSH含量降低，ROS表達(dá)強(qiáng)度增高。與單純外傷組相比，TBI后Nrf2(-/-)小鼠中GSH表達(dá)含量明顯降低(P＜0.05)，ROS表達(dá)強(qiáng)度明顯增高(P＜0.0001)。
　　3.TBI后激活ROS表達(dá)強(qiáng)度后，GSH的含量顯著下降，泛素化蛋白表達(dá)明顯增多。與單純外傷組相比，使用FAC刺激ROS生成后(P＜0.0001)，出現(xiàn)GSH含量的下降(P＜0.05)，和泛素化蛋白的增多(P＜0.01)。
　　

12、4.TBI后抑制ROS表達(dá)強(qiáng)度后，GSH的含量，泛素化蛋白的表達(dá)明顯減少。與單純外傷組相比，使用NAC抑制ROS生成后(P＜0.0001)，出現(xiàn)GSH含量的升高(P＜0.05)，和泛素化蛋白的減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.TBI后激活表達(dá)Nrf2，可以增加GSH含量，同時(shí)減少ROS表達(dá)強(qiáng)度;TBI后抑制表達(dá)Nrf2，可以明顯減少GSH含量，同時(shí)顯著增強(qiáng)ROS表達(dá)強(qiáng)度。
　　2.TBI后激活表達(dá)ROS，可以

13、使GSH的含量顯著下降，泛素化蛋白表達(dá)明顯增多，UPS活性下降;TBI后抑制表達(dá)ROS，可以使GSH的含量顯著增高，泛素化蛋白表達(dá)明顯減少，UPS活性增高。
　　3.Nrf2通過氧化還原平衡(GSH/ROS)來調(diào)控UPS的活性。
　　第三部分:神經(jīng)元TBI模型中Nrf2-ARE通路對(duì)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)的作用
　　目的:
　　在體外環(huán)境中驗(yàn)證Nrf2，氧化還原平衡，UPS三者之間的關(guān)系。
　　方法:

14、
　　1.神經(jīng)元的培養(yǎng):選取孕17-19天的成年雌性ICR及Nrf2(-/-)小鼠，斷頸處死后，放入酒精中消毒。
　　2.神經(jīng)元的分組及外傷模型:培養(yǎng)成熟后的ICR神經(jīng)元隨即分為:對(duì)照組，外傷組，外傷+tBHQ組，外傷+FAC組，外傷+NAC組。
　　3.藥物的處理:用培養(yǎng)基配制tBHQ至最終濃度為10uM，于TBI前2小時(shí)加入六孔板中，每孔加入2ml。
　　4.western blot檢測(cè):分別利用12％，10

15、％的凝膠電泳分離核蛋白，漿蛋白，檢測(cè)各組核蛋白。
　　5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR:按照試劑盒說明，進(jìn)行目標(biāo)基因Nrf2的qPCR檢測(cè)。
　　6.活性氧的熒光檢測(cè):按照試劑盒說明進(jìn)行操作，先原位裝載探針，孵育20分鐘后清洗3遍。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SEM)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　

16、　1.神經(jīng)元TBI模型后激活Nrf2的表達(dá)可以有效促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)移，同時(shí)減弱ROS的表達(dá)。使用tBHQ激活Nrf2的表達(dá)，與單純外傷組相比發(fā)現(xiàn)TBI后Nrf2的核轉(zhuǎn)移增加(P＜0.05)，同時(shí)ROS的熒光強(qiáng)度變?nèi)?P＜0.001)。
　　2.神經(jīng)元TBI模型后抑制Nrf2的表達(dá)可以有限降低Nrf2的核轉(zhuǎn)移，同時(shí)ROS的表達(dá)增強(qiáng)。使用Nrf2(-/-)孕鼠培養(yǎng)成熟的神經(jīng)元中Nrf2含量顯著降低(P＜0.05)，與單純外傷組相比T

17、BI后Nrf2核轉(zhuǎn)移減少(P＜0.001)，同時(shí)ROS的表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。
　　3.神經(jīng)元TBI模型后激活ROS的表達(dá)可以增加泛素化蛋白的表達(dá)。與單純外傷組相比，使用FAC可以顯著激活ROS的表達(dá)(P＜0.01)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)泛素化蛋白增多(P＜0.01)。
　　4.神經(jīng)元TBI模型后抑制ROS的表達(dá)可以減少泛素化蛋白的表達(dá)。與單純外傷組相比，使用NAC可以顯著抑制ROS的表達(dá)(P＜0.001)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)泛素化蛋