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文檔簡介
1、α-硫辛酸(α-LA)是一種有效的自由基清除劑和天然抗氧化劑,它能清除各種自由基;螯合金屬離子;再生其它抗氧化劑;再生和增強(qiáng)其它抗氧化酶的作用。由于α-LA具有多功能、強(qiáng)大、廣譜、再生其他抗氧化劑的特點(diǎn),因此α-LA被譽(yù)為“萬能抗氧化劑”。
鎘是一種常見的環(huán)境重金屬污染物,其在自然界具廣泛存在,具有“致癌、致畸、致突變”的作用,是自然環(huán)境中的一種重要毒物。許多研究表明,鎘誘導(dǎo)的各種疾病與氧化損傷密切相關(guān),可以導(dǎo)致肝臟、腎臟、肺
2、部、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等產(chǎn)生氧化損傷性疾病。
谷胱甘肽是一種具有重要生理功能的天然活性肽,谷胱甘肽在自然界以氧化型谷胱甘肽(GSSG)和還原型谷胱甘肽(rGSH)兩種形態(tài)存在。rGSH在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境氧化還原穩(wěn)態(tài),保護(hù)蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子氧化損傷方面具有重要作用。
因此,本研究從α-LA再生谷胱甘肽還原酶(GR)的角度,深入探討α-LA再生rGSH及拮抗鎘致HepG2細(xì)胞氧化損傷的作用機(jī)制。為α-L
3、A作為一種潛在治療藥物應(yīng)用于鎘致氧化損傷性疾病的治療提供理論支持。
第一部分:α-LA拮抗鎘致HepG2細(xì)胞氧化損傷的作用
目的:探討α-LA對CdCl2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷的作用。
方法:本實(shí)驗(yàn)以HepG2細(xì)胞為研究對象,設(shè)一個(gè)正常組和五個(gè)處理組,分別為正常組(不施加任何處理因素);25μMCdCl2單獨(dú)作用組;100μMα-LA單獨(dú)作用組;25μM CdCl2+10μMα-LA聯(lián)合作用組;25
4、μM CdCl2+50μMα-LA聯(lián)合作用組;25μM CdCl2+100μMα-LA聯(lián)合作用組。聯(lián)合作用組按上述α-LA劑量預(yù)處理8h,然后按上述分組中α-LA和CdCl2濃度進(jìn)行染毒處理,染毒時(shí)間為16h。用四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)法檢測Hep G2細(xì)胞的活力,用DCFH-DA法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。
結(jié)果:與正常組相比,25μM CdCl2單獨(dú)作用組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01), ROS的水平顯著升高(P
5、<0.01);與25μM CdCl2單獨(dú)作用組相比,α-LA(50μM,100μM)和25μM CdCl2聯(lián)合作用組的細(xì)胞活力顯著升高(P<0.01),α-LA(10μM,50μM,100μM)和25μM CdCl2聯(lián)合作用組中的ROS的水平均降低(P<0.01或P<0.05)。
結(jié)論:α-LA可以拮抗CdCl2致HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激,降低CdCl2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的氧化損傷。
第二部分:α-硫辛酸再生谷胱甘
6、肽機(jī)制的研究
目的:從谷胱甘肽還原酶(GR)催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)再生還原型谷胱甘肽(rGSH)的途徑,探究α-LA再生rGSH的作用機(jī)制。
方法:染毒方法和實(shí)驗(yàn)分組同第一部分。用rGSH和GSSG檢測試劑盒檢測rGSH的水平及rGSH/GSSG比值,用DTNB法檢測GR的酶活力,用Western blotting方法檢測GR的蛋白表達(dá)量,用PCR技術(shù)檢測GR的mRNA表達(dá)水平。
結(jié)果:與正常組相比
7、,25μM CdCl2單獨(dú)作用組rGSH水平及rGSH/GSSG比值顯著降低(P<0.01),GR酶活力降低(P<0.05),GR mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05),GR蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01);與25μM CdCl2單獨(dú)作用組相比,α-LA(50μM,100μM)與25μM CdCl2聯(lián)合作用組中 rGSH水平及rGSH/GSS G比值顯著提高(P<0.01),α-LA(50μM,100μM)與25μM CdCl2聯(lián)合作
8、用組中GR酶活力提高(P<0.01或P<0.05),α-LA(10μM,50μM,100μM)與25μM CdCl2聯(lián)合作用組中mRNA水平顯著提高(P<0.01),α-LA(50μM,100μM)與25μM CdCl2聯(lián)合作用組中GR蛋白表達(dá)量顯著提高(P<0.01)。
結(jié)論:α-LA能夠誘導(dǎo)GR mRNA基因的表達(dá),促進(jìn)GR蛋白表達(dá)量的增加,提高GR的酶活力,催化GSSG轉(zhuǎn)化為rGSH,促進(jìn)rGSH的再生。
第三
9、部分:Nrf2/ARE信號(hào)通路在α-硫辛酸再生谷胱甘肽中的作用
目的:探討Nrf2/ARE信號(hào)通路在α-LA再生rGSH中的作用。
方法:染毒方法和實(shí)驗(yàn)分組同第一部分。用Western blotting方法檢測檢測p-Nrf2和Nrf2的蛋白表達(dá)量,計(jì)算出p-Nrf2/Nrf2比值,用細(xì)胞免疫化學(xué)染色法檢測α-LA對Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響。
結(jié)果:與正常組相比,25μM CdCl2單獨(dú)作用組中p-Nrf2/N
10、rf2比值顯著降低(P<0.01);與CdCl2單獨(dú)作用組相比,α-LA(10,50,100μM)與25μM CdCl2聯(lián)合作用組中p-Nrf2/Nrf2比值顯著升高(P<0.01)。
在正常組中,被染色的Nrf2幾乎全部集中在細(xì)胞質(zhì)中;在25μM CdCl2單獨(dú)作用組和100μMα-LA單獨(dú)作用組中,被染色的Nrf2大量分布在細(xì)胞質(zhì)中,少量分布在細(xì)胞核中;在α-LA(10,50μM)與25μM CdCl2聯(lián)合作用組中,被染色
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