Nrf2-ARE信號通路在腫瘤耐藥中的作用及相關(guān)機理的研究.pdf

1、論文分為二部分，主要內(nèi)容如下：
　　 第一部分構(gòu)建Nrf2低表達的穩(wěn)定細(xì)胞株，用于Nrf2小分子抑制劑作用機制的研究。采用shRNA-Nrf2轉(zhuǎn)染A549、H460細(xì)胞，通過Westernblotting、還原型谷胱甘肽(reduced-glutathione，GSH)檢測得到Nrf2低表達的穩(wěn)定細(xì)胞株A549-C27、H460-C9和H460-C13。在A549-C27中，小分子抑制劑木犀草素(Luteolin)作用后，GSH

2、無顯著性降低，同時對抗癌藥物的抗細(xì)胞增殖作用無明顯增強，而在對照組細(xì)胞中Luteolin可顯著增強抗癌藥物的作用。因此，Nrf2很可能是Luteolin增敏腫瘤細(xì)胞的重要靶點。在H460-C9和H460-C13細(xì)胞株中，MTS結(jié)果表明，抗癌藥物奧沙利鉑(Oxaliplatin)、阿霉素(Doxorubicin)和博來霉素(Bleomycin)的抗細(xì)胞增殖作用明顯增強。建立Nrf2低表達的穩(wěn)定細(xì)胞株，不僅可用于耐藥性的研究，而且為Nrf2

3、小分子抑制劑的研究提供便捷途徑。
　　 第二部分，進一步研究奧沙利鉑對結(jié)腸癌細(xì)胞Caco2中Nrf2-ARE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用及相關(guān)機理。奧沙利鉑作用后，采用檢測熒光素酶活性、Westernblotting、實時熒光定量PCR(Real-timePCR)等方法分析Nrf2調(diào)控的基因AKRlCl、NQO1、HO-1等蛋白質(zhì)表達及mRNA水平升高；進一步檢測GSH合成增加，活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)

4、水平降低。這些結(jié)果表明奧沙利鉑可激活Nrf2-ARE信號通路。在此，對其作用機制進行研究：染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation，ChIP)法分析表明，奧沙利鉑可增強Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性；實時熒光定量PCR分析顯示，在Keapl過量表達的A549-Cl細(xì)胞株中，奧沙利鉑可誘導(dǎo)HO-1的mRNA水平，這一結(jié)果表明，奧沙利鉑激活Nrf2需要Keap1參與；Westernblotting檢測發(fā)現(xiàn)奧沙利鉑可以誘