芹菜素通過抑制Nrf2-ARE通路逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥的研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,簡稱肝癌)是常見惡性腫瘤之一?；熓歉伟┲委煹闹匾侄?。然而,化療耐藥的存在,特別是多藥耐藥現(xiàn)象(multidrug resistance,MDR)是導(dǎo)致肝癌化療失敗的主要原因。
　　核轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞系相關(guān)因子-2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激調(diào)控因子,調(diào)控一系列細(xì)胞保護(hù)

2、基因的表達(dá)。目前,Nrf2已成為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的重要靶點(diǎn)之一。因此,開發(fā)以Nrf2為靶點(diǎn)的小分子抑制劑與抗腫瘤藥聯(lián)用,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥的敏感性,從而改善化療藥的治療效果,為腫瘤協(xié)同治療提供新途徑。
　　已發(fā)現(xiàn)一些黃酮類化合物是有效的Nrf2抑制劑,如表沒食子兒茶素3-沒食子酸酯(epigallocatechin 3-gallate,EGCG)、鴉膽子苦醇和木犀草素等。那么,芹菜素(4',5,7-trihydroxyflavone

3、,apigenin,APG)作為一種與EGCG、鴉膽子苦醇和木犀草素等Nrf2抑制劑結(jié)構(gòu)類似且同樣具有抗癌潛力的天然黃酮類物質(zhì),是否也能有效抑制Nrf2通路,進(jìn)而增敏腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)耐藥呢?目前尚未見相關(guān)報(bào)道。為此,本研究將研究APG對肝癌耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用,并從Nrf2通路探討其逆轉(zhuǎn)耐藥的作用機(jī)制。
　　第一部分：Nrf2與肝癌阿霉素耐藥相關(guān)性的研究
　　目的:探討肝癌中Nrf2的表達(dá)與阿霉素(doxorubicin,ADM)

4、化療耐藥的關(guān)系。
　　方法:免疫組化法檢測Nrf2、醛酮還原酶1B10(aldo-keto reductase 1B10,AKR1B10)、多藥耐藥相關(guān)蛋白5(multidrug resistance-associated protein 5,MRP5)在肝癌組織中的表達(dá),分析Nrf2表達(dá)與AKR1B10、MRP5表達(dá)及與肝癌臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系,免疫蛋白印跡法檢測比較Nrf2在人肝癌親本細(xì)胞株BEL-7402細(xì)胞和ADM選擇

5、性誘導(dǎo)的多藥耐藥細(xì)胞株BEL-7402/ADM細(xì)胞中的表達(dá)差異,通過siRNA干擾Nrf2表達(dá)后,MTT法檢測細(xì)胞對ADM敏感性的變化。
　　結(jié)果:Nrf2、AKR1B10和MRP5在肝癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌周正常組織(P<0.01;P<0.01;P<0.01),肝癌組織中AKR1B10和MRP5表達(dá)水平均與Nrf2表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(P=0.009;P=0.016)。在肝癌中,Nrf2的表達(dá)與腫瘤分化程度(P=0.017)

6、、TNM分期(P=0.028)、肝硬化病史(P=0.017),早期復(fù)發(fā)(P=0.016)密切相關(guān)。Nrf2在肝癌耐藥細(xì)胞株BEL-7402/ADM較敏感細(xì)胞株BEL-7402中蛋白表達(dá)顯著增加,且干擾Nrf2基因表達(dá)后,肝癌耐藥細(xì)胞株BEL-7402/ADM對ADM的敏感性顯著增強(qiáng)。
　　結(jié)論:本研究表明肝癌中Nrf2的高表達(dá)可能與ADM耐藥相關(guān)。
　　第二部分：芹菜素通過抑制PI3K/Akt/Nrf2通路逆轉(zhuǎn)BEL-740

7、2/ADM耐藥
　　目的:Nrf2是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激調(diào)控因子,調(diào)控一系列細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)。目前,Nrf2已成為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的重要靶點(diǎn)之一。在本實(shí)驗(yàn)中,我們將研究APG是否可以通過抑制Nrf2通路進(jìn)而逆轉(zhuǎn)BEL-7402/ADM細(xì)胞耐藥。
　　方法:MTT實(shí)驗(yàn)檢測APG對BEL-7402/ADM細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)情況。熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測APG對細(xì)胞內(nèi)ADM濃度的影響。實(shí)時(shí)定量PCR和免疫蛋白印跡法分析APG對Nr

8、f2通路的抑制作用。
　　結(jié)果:在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)無毒劑量的APG可明顯增強(qiáng)BEL-7402/ADM對抗癌藥的敏感性,增加細(xì)胞內(nèi)ADM蓄積。機(jī)制上,APG通過抑制PI3K/Akt信號通路,進(jìn)而下調(diào)Nrf2mRNA和蛋白水平,并導(dǎo)致Nrf2下游基因HO-1、AKR1B10和MRP5表達(dá)減少,最終逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥。
　　結(jié)論:結(jié)果表明APG可通過下調(diào)PI3K/Akt/Nrf2信號通路,進(jìn)而增強(qiáng)人肝癌耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM

9、對ADM的敏感性,逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥。
　　第三部分：芹菜素聯(lián)合阿霉素對人肝癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用
　　目的:探討APG聯(lián)合ADM對人肝癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及其相關(guān)機(jī)制。
　　方法:建立BEL-7402裸鼠皮下移植瘤動(dòng)物模型,32只BEL-7402細(xì)胞株移植成功的裸鼠隨機(jī)分為四組:對照組、APG組(50mg/kg)、ADM組(3mg/kg)和聯(lián)合用藥組(APG50mg/kg+ADM3mg/kg),每組8只。上述藥物

10、每3d腹腔注射l次,共7次,觀察各組藥物對腫瘤的抑制作用。給藥結(jié)束后處死裸鼠,切取移植瘤組織。免疫組化法檢測Ki-67蛋白表達(dá)評價(jià)腫瘤細(xì)胞增殖。TUNEL染色評價(jià)腫瘤細(xì)胞凋亡情況。免疫蛋白印跡法檢測腫瘤組織Nrf2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:與單藥組相比,聯(lián)合應(yīng)用APG及ADM顯著抑制腫瘤生長,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞增殖。此外,聯(lián)合用藥還能下調(diào)腫瘤組織Nrf2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:本研究表明與APG或ADM單藥組相比,