α-硫辛酸拮抗氯化鎘致HepG2細(xì)胞氧化損傷及再生谷胱甘肽的作用機(jī)制.pdf

1、鎘（cadmium）是一種重金屬環(huán)境污染物，自上個(gè)世紀(jì)以來(lái),隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，鎘的生產(chǎn)和應(yīng)用不斷增加，人類向環(huán)境中排放的鎘濃度已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了自然本底的鎘濃度。目前，我國(guó)鎘污染形勢(shì)非常嚴(yán)峻，環(huán)境鎘污染事件及其引起的疾病時(shí)有報(bào)道。由于鎘污染生物效應(yīng)的多樣性和毒理機(jī)制的復(fù)雜性，對(duì)鎘毒性作用的研究一直是學(xué)術(shù)界的熱點(diǎn)研究課題。
　　鎘能對(duì)多種器官和組織造成損害，人體吸收過(guò)量的鎘可造成腎臟、肝臟、骨骼及睪丸損傷，甚至可引起癌癥。許多實(shí)驗(yàn)研究

2、表明,鎘的毒性作用與氧化損傷密切相關(guān)。急性鎘中毒時(shí)，鎘引起的氧化損傷與細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（glutathione，GSH）的耗竭有關(guān)。目前對(duì)鎘中毒尚無(wú)特效藥治療，有研究提出利用抗氧化方案來(lái)緩解鎘中毒，如補(bǔ)充維生素E、GSH、乙酰半胱氨酸（NAC）和SOD強(qiáng)化刺梨汁等，均能減輕或抑制鎘中毒所導(dǎo)致的氧化損傷和肝、腎毒性。
　　α-硫辛酸（alpha-lipoic acid,α-LA）是一種理想的生物抗氧化劑，能有效地清除活性氧（react

3、ive oxygen species，ROS）、螯合金屬離子、再生其他內(nèi)源性抗氧化物以及修復(fù)氧化損傷等。α-LA可以再生循環(huán)VitC、VitE、GSH、輔酶Q10等其他內(nèi)源性性抗氧化劑，因此是抗氧化劑網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的組成部分。近年來(lái)，α-LA在糖尿病、缺血再灌注損傷、阿爾茲海默癥等疾病的治療及重金屬解毒方面受到學(xué)者的廣泛關(guān)注，其醫(yī)用價(jià)值正在得到逐步認(rèn)可。GSH是一種重要的抗氧化劑，能夠清除體內(nèi)的自由基，參與機(jī)體多種生化反應(yīng),阻止體內(nèi)重要酶蛋

4、白巰基氧化。此外，GSH在提高機(jī)體免疫力、防止紅細(xì)胞溶血、解毒重金屬等方面也發(fā)揮重要作用。
　　因此，從α-LA再生GSH的角度,深入探討α-LA對(duì)鎘致人肝癌細(xì)胞HepG2氧化損傷的作用及α-LA再生GSH的機(jī)制至關(guān)重要，并為鎘致肝臟毒性及氧化損傷的防治措施提供新的學(xué)術(shù)思路。
　　第一部分、α-硫辛酸拮抗氯化鎘致HepG2細(xì)胞的氧化損傷
　　目的：探討α-LA干預(yù)鎘致HepG2細(xì)胞毒性的影響以及是否對(duì)其氧化損傷具有拮抗

5、作用。
　　方法：用單獨(dú)CdCl2（25μM）、α-LA（100μM）及聯(lián)合組（25μM CdCl2+100μMα-LA、25μM CdCl2+50μMα-LA、25μM CdCl2+10μMα-LA）處理HepG2細(xì)胞16 h。CdCl2染毒細(xì)胞前，聯(lián)合作用組按各自α-LA劑量預(yù)處理8h，其它組正常培養(yǎng)8h。采用四甲基偶氮噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞活力，硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定丙二醛（MDA）含量，二硝基苯甲酸（DTNB）法

6、測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSH含量及GSH/GSSG比值。
　　結(jié)果：CdCl2單獨(dú)染毒HepG2細(xì)胞16h后，與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.01），MDA含量明顯增加（P＜0.01），細(xì)胞內(nèi)GSH含量及GSH/GSSG比值下降（P＜0.01）；α-LA干預(yù)后，與CdCl2單獨(dú)染毒組相比，細(xì)胞活力隨α-LA濃度的增加逐漸升高（P＜0.05或P＜0.01），MDA水平在100μM和50μMα-LA作用后顯著下降（P＜0.05或P＜0

7、.01），細(xì)胞內(nèi)GSH含量在100μM和50μMα-LA作用后顯著增加（P＜0.01），GSH/GSSG比值顯著性升高（P＜0.01）。
　　結(jié)論：α-LA可以減輕CdCl2對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用，CdCl2損耗細(xì)胞內(nèi)GSH，破壞細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)的平衡，造成細(xì)胞一定程度的氧化損傷，α-LA干預(yù)使HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH含量增加，維持細(xì)胞內(nèi)正常的抗氧化防御狀態(tài)，減輕CdCl2對(duì)HepG2細(xì)胞的氧化損傷。
　　第二部分、α-

8、硫辛酸再生GSH的作用機(jī)制
　　目的：探討α-LA再生GSH的機(jī)制。觀察α-LA是否通過(guò)調(diào)控GSH合成限速酶的表達(dá)來(lái)影響G SH的再生。
　　方法：染毒方法和實(shí)驗(yàn)分組同第一部分。采用Western blotting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定HepG2細(xì)胞內(nèi)GCLC和GCLM蛋白和mRNA的表達(dá)水平，采用熒光技術(shù)微量滴定板分析法測(cè)定γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（γ-glutamyl cysteine ligase，γ-GCL）酶活

9、力。
　　結(jié)果：CdCl2單獨(dú)染毒HepG2細(xì)胞16 h后，與正常對(duì)照組相比，γ-GCL酶活力、GCLC和GCLM蛋白和mRNA的表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）；α-LA干預(yù)后，與CdCl2單獨(dú)染毒組相比，γ-GCL酶活力、GCLC和GCLM蛋白和mRNA的表達(dá)水平明顯增加，且隨α-LA處理濃度的增加表達(dá)水平逐漸增加。
　　結(jié)論：α-LA通過(guò)上調(diào)GCLC和GCLM亞基 mRNA的表達(dá)，增加GCLC和GCLM蛋