孤獨(dú)癥模型大鼠經(jīng)典Wnt信號(hào)通路與氧化應(yīng)激變化的研究.pdf

1、孤獨(dú)癥(autism)又稱自閉癥，是一種廣泛的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，一般于3歲前發(fā)病，嚴(yán)重影響兒童的語(yǔ)言形成、情緒認(rèn)知與社會(huì)行為。多數(shù)患兒有明顯的語(yǔ)言交流艱難、社交行為障礙、重復(fù)刻板行為三大核心臨床表現(xiàn)。這些患兒不能正常入托、上學(xué)，甚至將來(lái)也無(wú)法工作。近年來(lái)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)資料表明，autism的發(fā)病率逐年增多。Autism的病因不明，目前普遍認(rèn)為是遺傳和環(huán)境因素在腦發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期共同作用的結(jié)果。如，妊娠早期有丙戊酸鹽(Valproic acid

2、，VPA)用藥史的產(chǎn)婦，其子代發(fā)生autism風(fēng)險(xiǎn)大大增加。非遺傳因素可能與干擾胚胎腦發(fā)育的正常的信號(hào)通路傳導(dǎo)有關(guān)，而遺傳因素可能是信號(hào)通路傳導(dǎo)異常導(dǎo)致的基因突變所致。
　　 Writ/β-catenin信號(hào)通路對(duì)個(gè)體發(fā)育，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有重要的調(diào)控作用。在個(gè)體發(fā)育早期，它調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡與遷移以及突觸的形成與聯(lián)系，調(diào)控細(xì)胞、組織及器官正常有序的分化和生長(zhǎng)發(fā)育。然而Wnt通路猶如雙刃劍，既是調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞正常分化

3、發(fā)育的重要通路，又是神經(jīng)發(fā)育疾病發(fā)生的成因之一，通路中任何蛋白分子的異常，都將引起信號(hào)傳遞錯(cuò)誤，導(dǎo)致細(xì)胞命運(yùn)的改變，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)發(fā)育障礙疾病的發(fā)生，如autism。許多autism患者存在Wnt2編碼序列基因突變，故Wnt2基因是autism易感基因。敲除通路中散亂蛋白(Dishevelled，Dvl)-1基因的小鼠，表現(xiàn)出社交行為和感覺(jué)運(yùn)動(dòng)障礙，說(shuō)明Dvl-1基因可能參與動(dòng)物社會(huì)行為的形成，這可能與Dvl-1調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育有關(guān)，因?yàn)閺腄

4、vl-1敲除鼠組織培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元樹(shù)突發(fā)育異常。Dvl-1和Dvl-2缺失的小鼠，神經(jīng)管閉合不全。β-catenin轉(zhuǎn)基因小鼠，則能使神經(jīng)前體細(xì)胞增殖，導(dǎo)致巨大腦、腦皮質(zhì)容量增加，這可能與autism腦早期的過(guò)度增生有關(guān)。這些研究強(qiáng)烈提示W(wǎng)nt通路與autism的發(fā)病密切相關(guān)。
　　 近年來(lái)，大量臨床資料報(bào)道表明autism患者存在氧化應(yīng)激的失調(diào)，如氧化應(yīng)激生物標(biāo)記物分泌增加，體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化能力減少，能量代謝失調(diào)，線粒體功能障

5、礙。Dickkopf1(Dkk1)是一種分泌性的Wnt抑制劑。研究顯示，Dkk1轉(zhuǎn)染能顯著增加氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平。Nucleoredoxin(NRX)作為一種氧化還原劑，通過(guò)與Dvl作用，對(duì)Wnt信號(hào)通路進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。H2O2作用于細(xì)胞減少了NRX和Dvl的相互作用，導(dǎo)致T細(xì)胞因子(T cell factor，TCF)暫時(shí)激活。而與這些結(jié)果截然相反的許多研究顯示，H2O2誘導(dǎo)

6、ROS依賴性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制了β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性。ROS能抑制許多磷酸酶，而H2O2處理后GSK3怎么去磷酸化并不清楚。有趣的是，有研究顯示，Dvl高表達(dá)能改善H2O2誘導(dǎo)的β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性抑制。因此，這些研究提示ROS依賴于Dvl在調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路中起雙重作用。這也說(shuō)明氧化應(yīng)激與Wnt信號(hào)通路之間存在關(guān)聯(lián)。
　　 那么，autism動(dòng)物模型是否存在氧化應(yīng)激異常?在autism產(chǎn)生過(guò)程中氧化應(yīng)激

7、與Wnt信號(hào)通路是否存在關(guān)聯(lián)?用Wnt信號(hào)通路特異性抑制劑是否能改善autism行為學(xué)異常?目前尚不清楚。針對(duì)這些問(wèn)題，本課題集中研究autism動(dòng)物模型及培養(yǎng)神經(jīng)元中氧化應(yīng)激與Wnt/β-catenin通路相關(guān)分子的關(guān)系，以探討autism發(fā)病的相關(guān)分子機(jī)制。我們主要進(jìn)行了以下三方面的工作：
　　 一、建立并檢測(cè)了autism動(dòng)物模型。采用Wistar大鼠，在妊娠第12.5天時(shí)，腹腔注射(Intraperitoneal inj

8、eeting，ip)VPA制作子代autism大鼠模型，并運(yùn)用熱板致痛法、傾斜板實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮等方法對(duì)模型大鼠進(jìn)行發(fā)育與行為學(xué)檢測(cè)。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，autism模型組大鼠腦發(fā)育異常、睜眼時(shí)間推遲、方向趨向性機(jī)能及傷害性知覺(jué)下降、游泳能力差、重復(fù)刻板動(dòng)作增加、學(xué)習(xí)記憶和空間探索能力差。這些表現(xiàn)與人類autism患者的某些特征極為相似，表明用VPA注射法較成功地制作出了autism大鼠模型。
　　 二、研究了W

9、nt/β-catenin信號(hào)通路及氧化應(yīng)激水平。運(yùn)用Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)autism模型大鼠前額葉皮層(Prefrontal cortex，PFC)和海馬(Hippocampus，HC)兩腦區(qū)Wnt通路信號(hào)蛋白GSK-3β，磷酸化GSK-3β(Phosphorylated GSK-3β，P-GSK-3β)，β-catenin，磷酸化β-catenin(Phosphorylatedβ-catenin

10、，P-β-catenin)及氧化應(yīng)激標(biāo)記物4-羥壬烯醛(4-Hydroxynonenal，4-HNE)，硫氧還原蛋白(Thioredoxin，Trx)等相關(guān)分子的表達(dá)。進(jìn)而我們檢測(cè)了Wnt信號(hào)通路的特異性抑制劑Sulindac對(duì)氧化應(yīng)激的影響。Western Blot結(jié)果顯示，在autism模型大鼠PFC和HC腦區(qū)，Wnt通路關(guān)鍵信號(hào)蛋白失活的P-GSK-3β上調(diào)，抑制性的P-β-catenin下調(diào)，差異顯著高于對(duì)照組(P<0.001)

11、。同時(shí)，氧化應(yīng)激標(biāo)記物4-HNE表達(dá)增加(P<0.01)，Trx表達(dá)減少(P<0.05)。Real-time PCR結(jié)果顯示，autism模型組大鼠PFC和HC腦組織GSK-3β mRNA水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而β-catenin mRNA水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。同時(shí)，抗氧化基因trx1，trx2 mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。Writ信號(hào)通路的特異性抑制劑Sulindac作用以后，與autism模型大鼠相

12、比，VPA+Sulindac處理組失活的P-GSK-3β下調(diào)(P<0.05)，抑制性的P-β-catenin上調(diào)(P<0.05)，而氧化應(yīng)激標(biāo)記物4-HNE減少(P<0.05)。行為學(xué)研究結(jié)果顯示，與autism模型大鼠相比，Sulindac預(yù)處理，大鼠的痛閾相對(duì)正常；重復(fù)刻板動(dòng)作減少；學(xué)習(xí)和記憶能力有所提高。以上結(jié)果表明，Wnt信號(hào)通路抑制劑Sulindac預(yù)處理，能削弱Wnt信號(hào)通路的亢進(jìn)機(jī)能，從而減少氧化應(yīng)激的發(fā)生，最終使auti

13、sm模型鼠的異常行為獲得不同程度的改善。
　　 三、采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)探討了Wnt/β-catenin通路與氧化應(yīng)激在autism發(fā)生過(guò)程中的作用。應(yīng)用Real-time PCR，Western blot及流式細(xì)胞分析(Flow analyticalcytometry system，F(xiàn)ACS)技術(shù)深入研究VPA處理的原代培養(yǎng)神經(jīng)元Writ/β-catcnin與氧化應(yīng)激的關(guān)系。Real-time PCR及Western blot結(jié)果

14、顯示，在VPA處理培養(yǎng)神經(jīng)元中，GSK-3β mRNA及蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組，失活的P-GSK-3β顯著高于對(duì)照組；而β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組，抑制性的P-β-catenin顯著低于對(duì)照組。同時(shí)，在VPA處理培養(yǎng)神經(jīng)元中，4-HNE表達(dá)顯著高于對(duì)照組。FACS研究結(jié)果顯示，VPA處理組ROS表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。Sulindac處理以后，與VPA處理組相比，β-catenin蛋白表達(dá)下調(diào)，P-β-cate

15、nin表達(dá)上調(diào)，GSK-3β表達(dá)上調(diào)，P-GSK-3β表達(dá)下調(diào)，4-HNE下調(diào)。Real-time PCR結(jié)果顯示，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)處理雖然減少了ROS的產(chǎn)生，但是并沒(méi)有改變GSK-3β mRNA和13-catenin mRNA的表達(dá)。以上結(jié)果揭示，Wnt/β-catenin通路活性增強(qiáng)導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，VPA促進(jìn)神經(jīng)元氧化應(yīng)激的產(chǎn)生由于該通路上調(diào)所致。
　　 綜上所述，我們