原花青素通過NrF-2信號通路對大鼠肌腱抗氧化應(yīng)激作用的研究.pdf

1、目的：原花青素可以通過上調(diào)Nrf-2通路明顯的抑制氧化應(yīng)激對多種組織器官造成的損傷，但該作用在肌腱組織中鮮見報道。本文旨在研究原花青素對肌腱抗氧化應(yīng)激的作用，初步明確原花青素的抗氧化作用機制，為肌腱損傷的發(fā)病機制及治療提供實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　方法：一、細(xì)胞實驗1、從SD大鼠肌腱組織中提取肌腱干細(xì)胞(tendon-derived stem cells，TDSCs)，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)至第3代，用于后續(xù)實驗。2、通過流式細(xì)胞術(shù)對提取

2、的TDSCs進(jìn)行細(xì)胞種類鑒定。3、以不同濃度的原花青素(Proanthocyanidins，PCs)單獨作用于TDSCs，排除PCs對TDSCs的毒副作用。4、以不同濃度的H2O2作用于TDSCs，摸索構(gòu)建氧化應(yīng)激模型的最佳濃度——半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。5、將半抑制濃度的H2O2作用于經(jīng)不同濃度的PCs預(yù)處理的TDSCs，并通過CCK-8法來測定TDSCs的細(xì)

3、胞活性。6、應(yīng)用Real Time-PCR法及Western Blot法檢測PCs對TDSCs中Nrf-2基因及其下游GCLM、HO-1、NQO-1基因表達(dá)的影響。二、動物實驗1、取15只成年雄性SD大鼠，分為空白組、對照組（過度使用模型組）、實驗組(PCs預(yù)處理+過度使用組)三組，每組5只。2、對空白組、對照組中的大鼠僅以滅菌水灌胃，而實驗組則以100mg/kg PCs灌胃。3、將SD大鼠放置于大鼠跑臺上，以17m/min的速度進(jìn)行1

4、0°的上坡跑，每天進(jìn)行1h，每周進(jìn)行5天，以建立肌腱過度使用的模型。在進(jìn)行正式模型建立之前，進(jìn)行5天適應(yīng)訓(xùn)練。4、建立模型2周后取大鼠眼球血血清，進(jìn)行氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA、抗·OH及抗O2·-的測定。5、取SD大鼠肌腱組織，行病理切片HE染色。
　　結(jié)果：1、分離的TDSCs在P3呈紡錘狀、多角狀等形態(tài)生長，并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對其表面標(biāo)記物測定結(jié)果顯示，有96.8％的細(xì)胞對間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記CD90（陽性標(biāo)記物）高表達(dá)，僅有0.

5、65％對內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31表達(dá)（陰性標(biāo)記物），并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果證實分離細(xì)胞為TDSCs。2、在CCK-8試驗中，不同濃度的PCs單獨作用于TDSCs，細(xì)胞活性無明顯差異，證實PCs對TDSCs無明顯毒副作用。且在H2O2的處理下，經(jīng)PCs預(yù)處理的TDSCs細(xì)胞活性明顯高于H2O2組，且各濃度PCs組之間的細(xì)胞活性無明顯差異，證實PCs在低濃度狀態(tài)下即可發(fā)揮出強大的抗氧化作用。3、在RT-PCR檢測中，與對照組相比，H2O2和PCs的

6、單獨作用都可上調(diào)TDSCs中Nrf-2及其下游基因GCLM、NQO-1、HO-1的表達(dá)，且PCs的作用更明顯，而PCs+ H2O2組的各個基因表達(dá)均達(dá)到最高水平。4、在WB檢測中，雖然在各種組中Nrf-2的蛋白表達(dá)無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，但在各組間的表達(dá)中呈上升的趨勢。而GCLM及HO-1的表達(dá)在H2O2、PCs、PCs+ H2O2三組中的表達(dá)依次增高，與RT-PCR結(jié)果一致。5、在動物實驗中，過度使用組MDA水平明顯增高，表明大鼠肌腱過度使

7、用模型造模成功，且SOD活性、抗·OH及抗O2·-能力在過度使用組中均有相應(yīng)增強。而PCs組中MDA水平較過度使用組明顯降低，顯示出PCs的抗氧化作用，同時SOD活性、抗·OH及抗O2·-能力也得到了較大的增強。6、在大鼠肌腱的病理切片中，低倍鏡(100×)下可見在正常肌腱組織內(nèi)，肌腱纖維蛋白組織互相平行，且相互排列緊密有序。在高倍鏡(400×)下可見細(xì)胞核深染且呈紡錘型或梭型，位于肌腱纖維蛋白組織中央。而在過度使用組中，可見到肌腱纖維

8、蛋白組織明顯的紊亂甚至斷裂，而細(xì)胞核變圓且著色加深。經(jīng)PCs處理的大鼠肌腱組織，在病理切片中可見比較明顯的結(jié)構(gòu)紊亂，排列稀疏，但未見明顯的肌腱纖維斷裂。雖然實驗組的細(xì)胞核也有向圓形發(fā)展的趨勢，但仍可見少量梭型或紡錘形的細(xì)胞核?？梢娊?jīng)PCs處理后肌腱組織在形態(tài)學(xué)上較過度使用組有明顯的改觀。
　　結(jié)論：1、PCs單獨作用于TDSCs時無明顯的細(xì)胞毒性作用，且能通過上調(diào)TDSCs中Nrf-2的表達(dá)，從而進(jìn)一步上調(diào)其下游基因GCLM、NQ