生長激素促分泌素受體基因敲除小鼠的建立及胃排空表型研究.pdf

1、生長激素促分泌素受體(GH S-R)編碼366個氨基酸，屬于G蛋白偶聯(lián)受體，主要分布在丘腦及垂體，與其內源性配體ghrelin結合后除了促生長激素釋放作用以外還可以通過中樞和外周兩種方式調節(jié)胃動力。GHS-R在胃動力調控上的機制尚不清楚。因此，本研究建立了GHS-R基因敲除小鼠模型，從胃排空方面研究了GHS-R基因敲除對小鼠胃排空的影響。為了探討其機理，使用基因芯片技術研究了敲除小鼠丘腦基因表達譜。 本研究采取置換型基因敲除載體

2、，使用正負篩選策略。用TK-neo置換原X-pPNT載體的PGK-neo構建目標載體骨架。以小鼠基因組DNA為模板，用PCR方法擴增兩條同源臂，將其按照一定方向裝入含有TK-neo的X-pPNT載體，并測序鑒定。載體經(jīng)線性化及純化后電穿孔轉染小鼠ES細胞，用G418和Gancyclovir對電穿孔轉染后的ES細胞進行正負篩選培養(yǎng)，得到雙藥抗性ES細胞克隆后抽提基因組DNA，分別用PCR方法鑒定兩條同源臂，并測序確定成功同源重組的ES細胞

3、克隆。經(jīng)ES細胞顯微注射及囊胚移植，獲得嵌合體小鼠，再由雜交育種得到純合子小鼠。以RT-PCR及免疫印跡實驗檢測了敲除小鼠GHS-R的mRNA及蛋白表達水平。使用13C-辛酸標記試餐，進行13 CO2呼氣試驗，對基因敲除小鼠的胃排空進行了體內實驗研究。為了探討GHS-R敲除對小鼠胃排空影響的中樞作用機制，使用基因芯片研究了丘腦表達譜。 結果：成功構建了基因敲除載體，獲得了基因敲除小鼠，并從mRNA及蛋白兩個水平證實其GHS-R無

4、表達。敲除小鼠胃排空較野生型小鼠要緩慢。液體試餐：GEC敲除小鼠為7.74±0.34>野生型小鼠的6.10±0.28(P=0.005)；固體試餐：t1/2(分鐘)敲除小鼠為112.43±5.69>野生型小鼠的83.96±3.95(P=0.004)；tlag(分鐘)敲除小鼠為53.76±2.52>野生型小鼠的32.77±3.18(P=0.001)。丘腦基因芯片結果顯示敲除小鼠基因表達的變化主要集中在生理功能的正向調控、蛋白代謝過程、細胞蛋