肌肉生長(zhǎng)抑制素基因敲除肉牛的研究.pdf

1、肌肉生長(zhǎng)抑制素(MSTN)是特異性骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育負(fù)調(diào)控因子,其活性的喪失或降低,會(huì)引起動(dòng)物肌肉的過度發(fā)育,牛MSTN基因的自然突變會(huì)引發(fā)“雙肌”現(xiàn)象。相對(duì)于自然雜交育種來說,通過基因打靶技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有育種周期短、遺傳性狀穩(wěn)定等特點(diǎn)。本研究針對(duì)牛MSTN基因,構(gòu)建同源重組打靶載體,對(duì)牛胎兒成纖維細(xì)胞實(shí)施電轉(zhuǎn)染,進(jìn)而用同源重組陽性細(xì)胞通過體細(xì)胞核移植技術(shù)制備牛MSTN基因敲除胚胎,并進(jìn)行胚胎移植獲得妊娠母牛。本研究結(jié)果可為優(yōu)良家畜的

2、生產(chǎn)及MSTN基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　 1.牛MSTN基因敲除打靶載體的構(gòu)建
　　 構(gòu)建兩套用于牛MSTN基因敲除的置換型打靶載體pPLP-MSTN和PⅢ-MSTN。pPLP-MSTN為常規(guī)同源重組打靶載體,包含2.8kb同源短臂和4.0kb同源長(zhǎng)臂,具有含PGK啟動(dòng)子的Neor基因作為正篩選標(biāo)記；載體PⅢ-MSTN為綠色熒光蛋白啟動(dòng)子捕獲打靶載體,包含1.3kb同源短臂和6.8kb同源長(zhǎng)臂,具有無啟動(dòng)子的綠色熒光

3、蛋白基因和含PGK啟動(dòng)子的.Neor基因作為雙正篩選標(biāo)記。兩套打靶載體的同源臂均克隆自和牛耳組織細(xì)胞。
　　 2.MSTN基因敲除牛胎兒成纖維細(xì)胞的制備
　　 利用線性化打靶載體pPLP-MSTN電擊轉(zhuǎn)染大連雪龍黑牛、和牛與魯西黃生的胎兒成纖維細(xì)胞,經(jīng)G418篩選共獲得了363個(gè)G418抗性克隆,經(jīng)PCR鑒定沒有發(fā)生同源重組的陽性克?。焕镁€性化打靶載體PⅢ-MSTN電擊轉(zhuǎn)染和牛與魯西黃牛的胎兒成纖維細(xì)胞,經(jīng)G418篩選

4、分別獲得了104和164個(gè)G418抗性克隆,經(jīng)熒光顯微鏡鏡檢分別獲得了20和29個(gè)具有抗性的綠熒光克隆。通過PCR鑒定與測(cè)序分析,在20個(gè)有抗性的綠熒光和牛細(xì)胞克隆中,獲得一個(gè)表達(dá)綠色熒光的MSTN基因敲除克隆,相對(duì)打靶效率為5.00％(1／20),絕對(duì)打靶效率為0.27×10-7(1／3.4×107)；在29個(gè)有抗性的綠熒光魯西黃牛細(xì)胞克隆中,沒有發(fā)現(xiàn)同源重組的陽性克隆。
　　 3.MSTN基因敲除牛胚胎的制備與移植