虹膜睫狀體免疫細(xì)胞活性變化及與角膜移植免疫排斥關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究前房免疫微環(huán)境與角膜移植免疫排斥反應(yīng)之間的關(guān)系，進(jìn)一步揭示角膜免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)理。 方法 1、實(shí)驗(yàn)分組A組，同系移植組：供體為BA[,B／c小鼠，受體為BA~,B／c小鼠。B組，異系移植組：供體為C57B[拍小鼠，受體為BAI。B／c小鼠。C組，正常健康的BALB／c小鼠，不作任何處理。 2、大體觀察術(shù)后3天拆除眼瞼縫線，采用裂隙燈顯微鏡觀察角膜植片透明情況，前兩周每天觀察，之后所有小鼠每周觀察2～

2、3次至術(shù)后2個月。 3、免疫組織化學(xué)方法檢測免疫細(xì)胞的變化情況 (1)眼球冰凍切片術(shù)后3天、7天、10天、排斥時及1．5月，隨機(jī)從各組抽取2只小鼠，頸椎脫臼法處死小鼠后取右側(cè)眼球，冰凍切片檢測MHC Ⅱ、CD4及F4／80的浸潤情況。 (2)虹膜睫狀體組織鋪片術(shù)后5、10天、排斥及1．5月時，從A、B兩組各取8只小鼠，分離虹膜組織。另取8只正常BAL,B／c小鼠，作為正常對照。應(yīng)用抗原提呈細(xì)胞的標(biāo)記MHCll分子

3、，巨噬細(xì)胞的標(biāo)志F4／80以及共刺激分子CD86／CD80，和CD4．+T淋巴細(xì)胞標(biāo)記，檢測角膜移植術(shù)后不同動物模型不同時間虹膜組織中免疫細(xì)胞的變化情況并觀察它們與角膜移植免疫排斥反應(yīng)的關(guān)系。 4、分子生物學(xué)方法檢測虹膜睫狀體組織中細(xì)胞因子的表達(dá)．術(shù)后5、7、10天及排斥時，從A、B兩組分別隨機(jī)選取2只小鼠，另取2只正常BAI。B／C小鼠作為正常對照。采用RT-PCR方法檢測角膜移植術(shù)后不同時間虹膜睫狀體組織中的CCR5、CCR

4、．7、IL．12、IL．4的表達(dá)。應(yīng)用Image．J圖象分析軟件統(tǒng)計(jì)每條目的基因與內(nèi)參的光密度比值，各組進(jìn)行比較，SPSSll．5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。 (P<0．05為差別有顯著意義) 結(jié)果 1、大體觀察B組小鼠術(shù)后角膜植片逐漸水腫混濁，新生血管長入，于12～20天內(nèi)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)：A組小鼠角膜植片在觀察時問內(nèi)始終保持透明。 2、免疫組織化學(xué)方法檢測虹膜睫狀體組織細(xì)胞的變化情況，MHCⅡ：眼球冰凍切片顯示正常小鼠

5、角鞏膜緣及虹膜組織基質(zhì)層散在分布MHC Ⅱ+的細(xì)胞，穿透性角膜移植術(shù)(PK)后MHC Ⅱ+細(xì)胞逐漸向角膜中央浸潤(植片)，至排斥時可見植片、植床及虹膜組織均有大量MHC Ⅱ+細(xì)胞浸潤。虹膜睫狀體鋪片顯示正常虹膜睫狀體組織存在樹枝狀MHC Ⅱ+細(xì)胞。A組，PK術(shù)后均可見虹膜組織樹枝狀的MHCⅡ+細(xì)胞表達(dá)，較正常的虹膜組織未見明顯的變化(F=I．425，P=0．271)。而B組，PK．術(shù)后5天可見虹膜組織MHC Ⅱ+細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且以圓

6、形或不規(guī)則形為主；PK術(shù)后10天MHC Ⅱ+細(xì)胞數(shù)量較5天時又明顯增多且多呈圓形，PK術(shù)后18天，虹膜組織Mt{C Ⅱ+細(xì)胞明顯增多達(dá)高峰，樹枝狀、圓形及不規(guī)則形共存。F4／80：眼球冰凍切片顯示正常小鼠角膜深基質(zhì)層及虹膜基質(zhì)層可見散在的F4／80+細(xì)胞，PK術(shù)后浸潤的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，至排斥時達(dá)高峰。虹膜睫狀體鋪片顯示正常虹膜睫狀體組織存在F4／80+細(xì)胞，近瞳孔區(qū)呈樹枝狀，近睫狀體側(cè)呈圓形。A組，PK術(shù)后均可見虹膜組織F4／80+細(xì)

7、胞表達(dá)，較正常的虹膜組織未見明顯的變化(F=0．291，P=0．831)。而B組，PK．術(shù)后F418ff}細(xì)胞的浸潤逐漸增多，至免疫排斥反應(yīng)時最多。共刺激分子：正常小鼠虹膜組織僅見少量CD86／CD80+細(xì)胞浸潤，A組小鼠角膜移植術(shù)后虹膜組織中共刺激分子的表達(dá)未見明顯的變化(F=0．028，P=0．870)。B組小鼠角膜移植術(shù)后5天時CD86／CD80+細(xì)胞的浸潤增多，但較正常未見明顯的變化(P=0．881)，10天時明顯增多至排斥時至

8、高峰。CD4+T。淋巴細(xì)胞：眼球冰凍切片顯示B組PK術(shù)后3天角膜植床、植片及虹膜睫狀體均未見明顯CD4斗T淋巴細(xì)胞浸潤；5天時在角鞏膜緣及睫狀體根部開始出現(xiàn)少量的CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤；7天時， CD4+T淋巴細(xì)胞逐漸向植片浸潤；至排斥時可見植片、植床及虹膜睫狀體組織大量的CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤。虹膜睫狀體組織鋪片顯示正常小鼠虹膜睫狀體組織未見CD4．+T淋巴細(xì)胞浸潤。A組，PK術(shù)后5天，10天，18天時，僅見散在的CD4+T‘淋巴細(xì)胞

9、浸潤(F=0．078，P=0．786)。而B組，PK術(shù)后5天可見少量的CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤，10天時CD4．+T淋巴細(xì)胞浸潤略增加，而排斥時達(dá)高峰，可見大量的CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤。分子生物學(xué)方法檢測虹膜睫狀體組織中細(xì)胞因子的表達(dá)。 RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，B組小鼠術(shù)后5，7，10天和排斥時均檢測到趨化性因子受體CCR5、CCR7的表達(dá)，且逐漸增多，至排斥時達(dá)高峰。IL．12在正常及A組小鼠虹膜睫狀體組織均無表達(dá)，B組角膜移植術(shù)