RelA修飾的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠角膜移植免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　角膜移植手術(shù)是目前治療角膜盲最主要、最有效的復(fù)明手段，但術(shù)后發(fā)生免疫排斥反應(yīng)仍然是導(dǎo)致移植失敗的最主要原因。雖然免疫抑制劑可以抑制免疫排斥反應(yīng)，但價(jià)格昂貴且毒副作用大，限制了它的長(zhǎng)期使用。因此近年來對(duì)角膜移植免疫排斥反應(yīng)的研究方向主要集中在誘導(dǎo)受體產(chǎn)生針對(duì)移植角膜的特異性免疫耐受。
　　已知樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)具有誘導(dǎo)移植免疫耐受的作用，同時(shí)研究表明，核因子-κB(NF-κB)與DC

2、發(fā)育成熟及抗原呈遞功能的關(guān)鍵性調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)，p50/RelA是NF-κB最常見的二聚體，是其發(fā)揮生物學(xué)功能的最主要形式。因此，本研究欲通過低表達(dá)RelA基因從而下調(diào)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，阻斷DC的成熟，并經(jīng)尾靜脈注射該DC回輸給受體，通過建立大鼠同種異體角膜移植模型，觀察其在角膜移植免疫反應(yīng)中的作用，以期為角膜移植免疫耐受提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:
　　探討低表達(dá)RelA基因的樹突狀細(xì)胞在大鼠角膜移植免疫

3、反應(yīng)中的作用。
　　方法:
　　(1)應(yīng)用GM-CSF和IL-4體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化供體大鼠骨髓源性DC，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、表型及功能加以鑒定。(2)應(yīng)用高效抑制RelA表達(dá)的shRNA序列，行慢病毒包裝并感染未成熟DC(命名為RelA-DC)，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照病毒感染DC組(命名為SiNC-DC)及未感染慢病毒DC組(命名為Control-DC)，分別給予1μg/ml的脂多糖刺激，利用RT-qPCR、Western Blot檢測(cè)

4、DC中RelA基因表達(dá);流式細(xì)胞儀分析DC表型;ELISA檢測(cè)DC上清IL-12和IFN-γ含量;MLR檢測(cè)DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力。(3)以SD大鼠為供體、Wistar大鼠為受體，建立大鼠同種異體角膜移植模型60例，隨機(jī)分成PBS組、mDC組、imDC組和RelA-DC組(n=15)，分別于移植前7天經(jīng)尾靜脈注射1ml PBS、mDC（5×106個(gè)）、imDC（5×106個(gè)）和RelA-DC（5×106個(gè)）;術(shù)后觀察角膜植片的存活

5、時(shí)間并評(píng)分;第14天取角膜植片行HE切片觀察、通過RT-qPCR檢測(cè)Th1型細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ)和Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)的mRNA表達(dá)水平，取脾臟通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+Treg、CD4+FoxP3+Treg的陽性表達(dá)率及通過MLR觀察受體脾臟T細(xì)胞對(duì)供體抗原刺激的反應(yīng)能力。
　　結(jié)果:
　　(1)經(jīng)形態(tài)學(xué)、表型和功能學(xué)鑒定，證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為DC。(2)RelA-DC的RelA基因轉(zhuǎn)

6、錄水平和蛋白表達(dá)水平明顯低于SiNC-DC、Control-DC(P＜0.01);其表面分子(MHCⅡ、CD80、CD86)的表達(dá)水平、刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力及上清液細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ水平亦低于SiNC-DC、Control-DC(P＜0.05)。(3)RelA-DC組大鼠受體脾臟T細(xì)胞對(duì)供體抗原刺激的反應(yīng)能力、Th1型細(xì)胞因子水平低于PBS組，mDC組和imDC組(P＜0.05)，而角膜植片的存活時(shí)間、Th2型細(xì)胞因子水平