免疫排斥與器官移植

1、第五章 免疫排斥與器官移植,移植：應(yīng)用自體或異體的正常細(xì)胞、組織、器官置換病變的或功能缺損的細(xì)胞、組織、器官，以維持和重建機(jī)體生理功能的治療方法。 移植物：被移植的組織細(xì)胞或器官。供者：提供移植物的個(gè)體。受者：接受移植物的個(gè)體。,移植的類型,自體移植：指移植物取自受者自身。同系移植：指遺傳基因完全相同或基本相似個(gè)體之間的移植。同種移植：同種內(nèi)遺傳基因不同的個(gè)體之間的移植。異種移植：不同種屬個(gè)體間的移植。,移植抗原,概念：引

2、起移植排斥反應(yīng)的抗原類型： 1.主要組織相容性抗原 2.次要主要相容性抗原 3.血型抗原 4.組織特異性抗原,同種異型抗原的提呈與識(shí)別,直接識(shí)別：受者T細(xì)胞直接識(shí)別供者APC表面MHC分子或抗原肽-MHC分子復(fù)合物。 間接識(shí)別：受者T細(xì)胞識(shí)別經(jīng)過受者APC加工處理的來源于供者M(jìn)HC分子的肽。,,,直接識(shí)別 間接識(shí)別

3、,直接識(shí)別和間接識(shí)別比較,移植排斥反應(yīng)的效應(yīng)機(jī)制,細(xì)胞免疫應(yīng)答效應(yīng)機(jī)制體液免疫應(yīng)答效應(yīng)機(jī)制NK細(xì)胞效應(yīng)機(jī)制細(xì)胞因子的效應(yīng)機(jī)制,細(xì)胞免疫應(yīng)答效應(yīng)機(jī)制,受者CD4+ Th1細(xì)胞通過直接識(shí)別或間接識(shí)別途徑識(shí)別移植抗原并被激活，活化的T細(xì)胞釋放多種炎性細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-2等，引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)性炎癥，還可活化CD8+ CTL，產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)。,體液免疫應(yīng)答效應(yīng)機(jī)制,抗同種異型抗原的抗體與相應(yīng)抗原形成復(fù)合物，激活補(bǔ)體，損傷移植物。

4、抗體也可通過調(diào)理作用和ADCC作用對(duì)移植物造成損傷。,NK細(xì)胞效應(yīng)機(jī)制,在同種異體移植后，受者NK細(xì)胞的KIR不能識(shí)別移植物細(xì)胞表面的同種異型MHC分子，抑制信號(hào)傳入受阻，NK細(xì)胞被激活，參與移植排斥反應(yīng)。 活化T細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子也可活化NK細(xì)胞，增強(qiáng)其殺傷活性，參與對(duì)移植物的排斥。,細(xì)胞因子的效應(yīng)機(jī)制,IL-2活化同種異型反應(yīng)性T細(xì)胞；IFN-γ誘導(dǎo)MHC分子表達(dá)，增強(qiáng)APC活性，激活NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，參與并增強(qiáng)排斥

5、反應(yīng)；TNF-α是導(dǎo)致移植物損害的重要介質(zhì)；某些趨化性因子介導(dǎo)特定效應(yīng)性T細(xì)胞聚集于移植物，并參與排斥反應(yīng)發(fā)生。,同種異型移植排斥的類型,宿主抗移植物反應(yīng)移植物抗宿主反應(yīng): 1.超急性排斥反應(yīng) 2.急性排斥反應(yīng) 3.慢性排斥反應(yīng),超急性排斥反應(yīng),概念：移植器官與受者血管接通后數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生的排斥反應(yīng)。 機(jī)制：體液免疫介導(dǎo)，由于受者體內(nèi)預(yù)存有針對(duì)供者同種異型抗原的抗體所致。,

6、急性排斥反應(yīng),概念：發(fā)生在移植后數(shù)天至2周左右的排斥反應(yīng)。機(jī)制：1.CD4+ Th1細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)和CD8+ CTL直接殺傷表達(dá)同種異型抗原的移植物細(xì)胞，引起間質(zhì)細(xì)胞損害。2.機(jī)體產(chǎn)生的抗血管內(nèi)皮細(xì)胞表面同種異型抗原的抗體與相應(yīng)抗原形成免疫復(fù)合物，激活補(bǔ)體而損害移植物血管。3.激活的巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞參與移植物組織損傷。,慢性排斥反應(yīng),概念：發(fā)生于移植后數(shù)周、數(shù)月、 甚至數(shù)年的排斥反應(yīng)。 機(jī)制： 1.免疫學(xué)

7、因素 2.非免疫學(xué)因素,免疫學(xué)機(jī)制,1.特異性抗體或效應(yīng)細(xì)胞對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致血管損傷； 2.遲發(fā)型超敏反應(yīng)誘使巨噬細(xì)胞分泌平滑肌細(xì)胞生長因子，導(dǎo)致動(dòng)脈血管內(nèi)平滑肌細(xì)胞，血管壁增厚，間質(zhì)纖維化。,非免疫學(xué)機(jī)制,1.移植術(shù)后早期出現(xiàn)缺血-再灌注損傷；2.移植器官去神經(jīng)支配和血管損傷等；3.免疫抑制劑的毒副作用；4.受者并發(fā)高血壓、高脂血癥、糖尿病和慢性 巨細(xì)胞病毒感染等也可導(dǎo)致慢性排斥反應(yīng)。,,移植物抗宿

8、主反應(yīng),概念：移植物中的淋巴細(xì)胞識(shí)別宿主組織同種異型抗原而發(fā)生的一種排斥反應(yīng)。 前提條件: 1.受者與供者HLA型別不相配合； 2.移植物中含有足夠數(shù)量的免疫細(xì)胞，尤其是成熟的T細(xì)胞； 3.受者處于免疫無能或免疫功能極度低下的狀態(tài),GVHR機(jī)制,T細(xì)胞是介導(dǎo)GVHR的主要效應(yīng)細(xì)胞。骨髓移植物中成熟CD4+T細(xì)胞識(shí)別宿主的同種異型抗原，并增殖分化為效應(yīng)T細(xì)胞。這些激活的效應(yīng)細(xì)胞隨血流游走至受者全身，對(duì)宿主組織或器官發(fā)動(dòng)免

9、疫攻擊。,供受者的配合選擇,一般情況 ABO血型相容 HLA相容性,HLA分型試驗(yàn),血清學(xué)分型法細(xì)胞學(xué)分型法基因分型法,血清學(xué)分型法,原理：CDC 應(yīng)用：SD抗原（HLA-A、B、C、DR、DQ）。,技術(shù)要點(diǎn),（1）分離待檢的淋巴細(xì)胞，經(jīng)洗滌、計(jì)數(shù)后，配成一定濃度。檢測(cè)HLA-Ⅱ類抗原時(shí)，需分離B淋巴細(xì)胞。（2）取分型板，加入標(biāo)準(zhǔn)抗血清和待檢淋巴細(xì)胞，充分混勻，溫育。（3）加入補(bǔ)體，溫育。（4）加臺(tái)盼藍(lán)染色死細(xì)胞

10、。（5）用倒置顯微鏡觀察計(jì)數(shù)死細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。,CDC試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn),細(xì)胞學(xué)分型法,原理：淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)應(yīng)用：LD抗原（HLA-D、DP）類型： 1.雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法 2.單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法,雙向MLC方法原理,雙向MLC中的兩種淋巴細(xì)胞既是刺激細(xì)胞又是反應(yīng)細(xì)胞,彼此能發(fā)生相互作用。若彼此淋巴細(xì)胞均無形態(tài)學(xué)改變或細(xì)胞分裂增殖，說明兩個(gè)個(gè)體間HLA型別相同。若彼此淋巴細(xì)胞均發(fā)生形態(tài)學(xué)改變或細(xì)胞分裂增殖

11、，說明兩個(gè)個(gè)體間HLA型別不同。,雙向MLC方法技術(shù)要點(diǎn),1.分離待檢淋巴細(xì)胞，洗滌、計(jì)數(shù)，配成一定濃度。2.反應(yīng)管加雙方淋巴細(xì)胞，對(duì)照管分別加單方淋巴細(xì)胞。3.將細(xì)胞置CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)5～6天。4.取沉淀物涂片、染色，高倍鏡下計(jì)算轉(zhuǎn)化率，或在培養(yǎng)終止前16～20h加3H-TdR，培養(yǎng)后將細(xì)胞收集于濾膜，液閃儀測(cè)定cpm，計(jì)算SI。,單向MLC方法原理,單向MLC方法中的兩種淋巴細(xì)胞有刺激細(xì)胞和反應(yīng)細(xì)胞之分。首先將其中一種淋

12、巴細(xì)胞用絲裂霉素處理或X線照射，使其喪失免疫反應(yīng)能力，但HLA抗原不發(fā)生改變，因此被處理的細(xì)胞只作為刺激細(xì)胞，刺激細(xì)胞只能單向作用于反應(yīng)細(xì)胞，它刺激另一種未處理的淋巴細(xì)胞，使其發(fā)生淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖。,單向MLC方法類型,純合子分型細(xì)胞試驗(yàn)：陰性分型法預(yù)致敏淋巴細(xì)胞分型試驗(yàn)：陽性分型法,HTC試驗(yàn)原理,HTC是只表達(dá)一種LD抗原的細(xì)胞，即同源染色體上編碼LD抗原的MHC單倍型基因相同。這種細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素C處理或X線照射后，作為刺激細(xì)胞

13、。試驗(yàn)時(shí)將已知型別的HTC與待檢的淋巴細(xì)胞混合，進(jìn)行單向MLC。若待檢細(xì)胞不發(fā)生增殖反應(yīng)（SI<2），說明待檢細(xì)胞與HTC的HLA型別相同。因根據(jù)陰性反應(yīng)作為判定標(biāo)準(zhǔn)，故HTC試驗(yàn)又稱為陰性分型法；,PLT試驗(yàn)原理,預(yù)致敏淋巴細(xì)胞是一種僅對(duì)一種單倍型具有識(shí)別增殖能力，而處于靜止?fàn)顟B(tài)的淋巴細(xì)胞。這種細(xì)胞遇到相應(yīng)抗原刺激后，可迅速發(fā)生淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖。PLT試驗(yàn)是將此種細(xì)胞作為已知的分型細(xì)胞。正式試驗(yàn)時(shí)，將待檢淋巴細(xì)胞處理作為刺激

14、細(xì)胞，分別與一系列的預(yù)致敏淋巴細(xì)胞（反應(yīng)細(xì)胞）進(jìn)行單向MLC。如果待檢細(xì)胞與預(yù)致敏淋巴細(xì)胞預(yù)先識(shí)別的抗原相同，預(yù)致敏淋巴細(xì)胞會(huì)迅速增殖。因預(yù)致敏淋巴細(xì)胞分型試驗(yàn)是用陽性反應(yīng)作為判定標(biāo)準(zhǔn)，故PLT試驗(yàn)又稱為陽性分型法。,單向MLC方法的技術(shù)要點(diǎn),單向MLC方法的技術(shù)要點(diǎn)與雙向MLC方法類似，不同點(diǎn)有：①需提前篩選純合子分型細(xì)胞或制備預(yù)致敏淋巴細(xì)胞；②HTC試驗(yàn)中待檢細(xì)胞不需處理，作為反應(yīng)細(xì)胞，而PLT試驗(yàn)中待檢細(xì)胞需進(jìn)行處理，作為刺激細(xì)

15、胞；③形態(tài)學(xué)方法以轉(zhuǎn)化細(xì)胞百分率判斷淋巴細(xì)胞反應(yīng)程度，一般認(rèn)為轉(zhuǎn)化率小于5%為陰性；④3H-TdR摻入試驗(yàn)以刺激指數(shù)（SI）判斷淋巴細(xì)胞反應(yīng)程度。,基因分型法,RFLP分析法PCR-SSCP探針分型法PCR-SSP分型法PCR-SSCP PCR指紋圖譜技術(shù),限制性片段長度多態(tài)性分析法（RFLP）,RFLP是最早建立的研究HLA多態(tài)性的基因分析技術(shù)。根據(jù)不同個(gè)體間的HLA相應(yīng)堿基序列在不同部位存在多個(gè)不同酶切位點(diǎn)，通過一組限制

16、性內(nèi)切酶消化、識(shí)別、切割這些位點(diǎn)，產(chǎn)生數(shù)量和長度不一的DNA酶解片段，經(jīng)電泳分離，與相應(yīng)的cDNA探針進(jìn)行雜交，即可分析限制性片段長度多態(tài)性，借以確定HLA的型別，這種HLA分型法稱為DNA-RFLP。若對(duì)DNA片段進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后再進(jìn)行RFLP分析，則可大大提高RFLP的敏感度和特異性，這種引入DNA體外擴(kuò)增技術(shù)的限制性片段長度多態(tài)性分析則稱為PCR-RFLP分型法。,PCR-SSOP,PCR-SSOP分型法是將待檢細(xì)胞HLA基因片

17、段經(jīng)PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)移至NC膜或尼龍膜上，然后與放射性核素（32P）、生物素或地高辛等標(biāo)記的SSCP探針進(jìn)行雜交，若待檢DNA與已知核苷酸序列的探針互補(bǔ)，則兩者結(jié)合，即可分析出待檢DNA序列，據(jù)此確定HLA的基因型別。,,PCR-SSP分型法,PCR-SSP是根據(jù)HLA堿基序列的多態(tài)性和已知的DNA序列設(shè)計(jì)出一套針對(duì)每一等位基因的特異性引物，SSP 只能和相應(yīng)等位基因特異片段的堿基組列互補(bǔ)性結(jié)合。通過PCR技術(shù)將待檢DNA擴(kuò)增，產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)

18、的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，通過電泳分析確定HLA型別。,PCR-SSCP,單鏈DNA具有在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，可形成一定的空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)像的特點(diǎn)。即使長度相同的單鏈DNA其堿基順序不同，甚至單個(gè)堿基不同，所形成的構(gòu)像不同，電泳時(shí)泳動(dòng)速度和遷移率也不同。PCR-SSCP是指目的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增、變性后進(jìn)行SSCP分析，靶DNA中堿基序列的改變會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)移位。因此，若供、受者的SSCP帶型一致，則其HLA基因相匹配；若電泳帶型不一

19、致，則不匹配。,PCR指紋圖譜技術(shù),PCR反應(yīng)過程中，在特異性DNA最后一個(gè)循環(huán)的退火期，單鏈DNA互相結(jié)合形成同一個(gè)體完全互補(bǔ)的同質(zhì)雙鏈，但某些單鏈DNA還可能與不同個(gè)體的單鏈DNA形成不完全互補(bǔ)的異質(zhì)雙鏈。由于不同個(gè)體的DNA具有不同分子構(gòu)象，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中呈現(xiàn)特異的區(qū)帶圖譜，稱為PCR指紋圖譜。HLA基因分型時(shí)，將供、受體的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物混合，電泳后得出一指紋圖，再與二者各自的PCR指紋圖譜進(jìn)行比較，根據(jù)指紋圖的一致

20、性作為選擇供者的依據(jù)。,微量細(xì)胞毒試驗(yàn),用供者的淋巴細(xì)胞做靶細(xì)胞，與受者的血清進(jìn)行CDC，可檢出受者血清中是否含有針對(duì)供者淋巴細(xì)胞的抗體，以防止超急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。,流式細(xì)胞儀檢測(cè),將供者淋巴細(xì)胞與受者血清共育后，用熒光標(biāo)記的抗人Ig對(duì)結(jié)合有抗體的細(xì)胞染色，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行熒光標(biāo)記測(cè)定。該法比微量細(xì)胞毒試驗(yàn)的靈敏度高100倍。,混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),將受者與供者的淋巴細(xì)胞做雙向混合培養(yǎng)，或者與滅活供者的淋巴細(xì)胞做單向混合培養(yǎng)，細(xì)胞發(fā)生反

21、應(yīng)的程度與供、受者相容的程度呈負(fù)相關(guān)。,細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn),將受者淋巴細(xì)胞與滅活的供者淋巴細(xì)胞做常規(guī)單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，獲得致敏的受者淋巴細(xì)胞后，再與51Cr標(biāo)記的、PHA刺激的供者淋巴細(xì)胞做CML試驗(yàn)，51Cr釋放的程度與供、受者相容程度呈負(fù)相關(guān)。,交叉配合試驗(yàn),微量細(xì)胞毒試驗(yàn)流式細(xì)胞儀檢測(cè)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn),移植排斥的免疫學(xué)防治,一、排斥反應(yīng)的監(jiān)測(cè)二、排斥反應(yīng)的防治,排斥反應(yīng)的監(jiān)測(cè),細(xì)胞免疫學(xué)監(jiān)

22、測(cè)細(xì)胞因子監(jiān)測(cè)抗HLA抗體檢測(cè)蛋白、酶類、補(bǔ)體檢測(cè),排斥反應(yīng)的防治措施,移植抗原檢測(cè)與配型免疫抑制劑的使用移植耐受的誘導(dǎo),移植抗原的檢測(cè)與配型,1、HLA的檢測(cè) ：血清學(xué)檢測(cè) 細(xì)胞學(xué)檢測(cè) 基因檢測(cè)2、預(yù)存抗體檢測(cè)3、交叉配型,免疫抑制,1.藥物：CsA、Fk506 2. 單克隆抗體：抗CD3

23、單抗3. 血液凈化 ：去除已存在的抗體,Immunosuppressive agents,Immunosuppressive agents,TCR,,calcineurin,2+,NF-ATc,NF-ATn,NF-AT,,,,,Ca 2+,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,CsA,CyP,FK506,FKBP,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,FKBP,蛋白激酶,Rapamycin,IL-2,I

24、L-2R,輸血史對(duì)腎移植存活率的影響,移植前輸血次數(shù) 一年存活率 0 次 44% 1-4次 58% 5-9次 60% ?10次

25、 68%,,,,Blood transfusion and graft survival,,干細(xì)胞移植,干細(xì)胞：是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的早期未分化細(xì)胞。,干細(xì)胞的分類,胚胎干細(xì)胞 成體干細(xì)胞,干細(xì)胞的臨床應(yīng)用,作為細(xì)胞治療與組織器官替代治療的種子細(xì)胞研究胚胎發(fā)育的調(diào)控機(jī)制作為疾病基因治療的理想載體用于藥物篩選和新藥開發(fā),異種移植（xenograft）：

26、指不同種屬間的移植，是用手術(shù)的方法將某一種屬個(gè)體的器官或組織移植到另一種屬個(gè)體的某一部位。,異種移植的特殊免疫學(xué)問題,異種移植的特性,1、人體內(nèi)存在針對(duì)動(dòng)物細(xì)胞表面多糖分子的天然 IgM 抗體，導(dǎo)致超急排斥反應(yīng)。2. 遲發(fā)性異種移植排斥反應(yīng)可能由NK細(xì)胞和巨噬 細(xì)胞介導(dǎo)，涉及大量參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞和因子， 及相關(guān)基因的激活和表達(dá)。3．急性及慢性異種移植排斥反應(yīng)主要由T細(xì)胞介導(dǎo)。,異種移植的類型,協(xié)調(diào)

27、性 非協(xié)調(diào)性,骨髓移植的特殊免疫學(xué)問題,移植物抗宿主?。℅VHD）：是指供者的免疫活性細(xì)胞與免疫功能低下的受者抗原起反應(yīng)的一種疾病。,GVHD發(fā)生條件,宿主與移植物之間的組織相容性不同移植物中含有足量免疫活性細(xì)胞宿主處于免疫無能或免疫功能嚴(yán)重缺損,Graft versus host (GVH) disease,GVH反應(yīng)的臨床表現(xiàn)類型,組織器官 急性反應(yīng) 慢性反應(yīng)

28、皮膚 紅皮病 硬皮病 毛囊炎 丘疹性皮炎 脫屑 脫發(fā)肝臟 肝功能異常

29、 膽汁性肝硬化消化道 腹瀉、腸梗阻 黏膜結(jié)構(gòu)破壞 腸隱窩炎淋巴結(jié) 遲發(fā)性細(xì)胞增生 T、B細(xì)胞耗竭,,,,GVH disease in humans,本章小結(jié),1、移植與移植免疫的概念2、移植抗原的基本概念與類型3、HVG與GVH的反應(yīng)機(jī)制與類型4、移植排斥反應(yīng)的免

30、疫學(xué)特點(diǎn)5、移植排斥反應(yīng)的防治措施,68,,免疫網(wǎng)站,Immunology http://medmark.org/imm/Medweb:Immunology http://www.gen.emory.edu/medweb/medweb.immumology.htmlNational Jewish Medical and Research Center http://www.njc.oryAll about