對蝦細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移技術(shù)研究以及對蝦早期胚胎microRNAs的挖掘.pdf

1、對蝦病毒病的頻繁爆發(fā)已對世界對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，在體外建立永生性對蝦細(xì)胞系對于研究對蝦病毒的侵染機(jī)制以及制備有效的抗病毒藥物或疫苗具有十分重要的意義。將永生性轉(zhuǎn)化因子導(dǎo)入對蝦原代培養(yǎng)細(xì)胞是建立永生性對蝦細(xì)胞系的一種有效手段。但是由于體外培養(yǎng)對蝦細(xì)胞不分裂并且難以被轉(zhuǎn)染等問題，對蝦永生性細(xì)胞系一直未獲成功。因此，急需建立和完善適用于對蝦細(xì)胞的有效的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。目前，對蝦的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已有了初步的嘗試，所用表達(dá)載體分為非病毒和

2、病毒兩種。這些方法均存在較大的缺點(diǎn)，主要表現(xiàn)為高致死率和低轉(zhuǎn)化率。
　　本文擬(1)克隆對蝦翻譯控制腫瘤蛋白基因（TCTP）的啟動(dòng)子(Ptctp)和對蝦白斑病毒(WSSV)早期基因ie1的啟動(dòng)子(Pie1)，并將其分別插入病毒和非病毒表達(dá)載體中，構(gòu)建含有雙啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒，通過比較它們在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、魚類細(xì)胞和對蝦原代培養(yǎng)細(xì)胞中啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的活性，從而尋找適用于對蝦細(xì)胞的高效啟動(dòng)子。(2)將SV40增強(qiáng)子序列插入上述表達(dá)載體

3、中，研究其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和對蝦原代培養(yǎng)細(xì)胞中促進(jìn)質(zhì)粒入核的作用，以尋找適用于不分裂的對蝦培養(yǎng)細(xì)胞的促進(jìn)外源基因表達(dá)的增強(qiáng)子。(3)為了提高現(xiàn)有逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)對對蝦細(xì)胞的侵染偏好性，本文擬克隆對蝦白斑病毒W(wǎng)SSV的兩種主要囊膜蛋白基因:vp19和vp28，構(gòu)建真核表達(dá)載體，并通過共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞的方法，將其引入所包裝病毒顆粒的囊膜上，以期提高現(xiàn)有逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的嗜對蝦細(xì)胞性。(4)由于非編碼microRNAs在控制細(xì)胞分裂和

4、細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用，因此，本文擬通過生物信息學(xué)方法，從對蝦早期胚胎轉(zhuǎn)錄組序列中預(yù)測可能的microRNAs及其靶基因，從而對調(diào)控對蝦胚胎發(fā)育和細(xì)胞周期的相關(guān)microRNAs進(jìn)行挖掘。
　　在對蝦翻譯控制腫瘤蛋白基因啟動(dòng)子Ptctp的活性研究方面，我們成功克隆了刀額新對蝦和日本囊對蝦翻譯控制腫瘤蛋白基因的啟動(dòng)子序列，分別命名為Pme-tctp和Pmj-tctp，長度為612 bp，并利用軟件TFsearch和Match對其

5、可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測。同時(shí)，成功克隆了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(eGFP)的編碼框序列，然后以pMCs-GFP為基本質(zhì)粒（含啟動(dòng)子PLTR），利用雙酶切反應(yīng)將上述2種啟動(dòng)子分別定向插入該質(zhì)粒啟動(dòng)子(5' LTR)之后，綠色熒光蛋白基因(GFP)或eGFP序列之前，或以eGFP基因替換GFP基因，從而構(gòu)建了以下五種逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體質(zhì)粒，分別為:單啟動(dòng)子質(zhì)粒pMCs-PLTR-eGFP以及雙啟動(dòng)子質(zhì)粒pMCs-PLTR-Pme-

6、tctp-GFP、 pMCs-PLTR-Pmj-tctp-GFP、pMCs-PLTR-Pme-tctp-eGFP和pMCs-PLTR-Pmj-tctp-eGFP。通過脂質(zhì)體法將上述五種載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞Plat-GP后，在熒光顯微鏡下均可檢測到明顯的綠色熒光信號(hào)。與雙啟動(dòng)子質(zhì)粒相比，單啟動(dòng)子質(zhì)粒pMCs-PLTR-eGFP介導(dǎo)的綠色熒光表達(dá)效率和強(qiáng)度均最大，這表明在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中LTR啟動(dòng)子對基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)起主要作用，而Pme-t

7、ctp和Pmj-tctp的插入對LTR啟動(dòng)子啟動(dòng)下游報(bào)告基因的的表達(dá)造成了一定的影響。通過脂質(zhì)體法將上述五種表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染刀額新對蝦Oka器官原代培養(yǎng)細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)，單啟動(dòng)子質(zhì)粒pMCs-PLTR-eGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞中未觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)，而其他4種雙啟動(dòng)子質(zhì)粒均可檢測到綠色熒光，這表明雙啟動(dòng)子表達(dá)載體可在對蝦細(xì)胞中有效啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。PCR和RT-PCR檢測結(jié)果也表明，脂質(zhì)體法可以把表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入對蝦細(xì)胞中，但單啟動(dòng)子質(zhì)粒不能被轉(zhuǎn)錄

8、表達(dá)，雙啟動(dòng)子質(zhì)粒則可以被轉(zhuǎn)錄表達(dá)出mRNA，這與熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果一致。
　　在提高現(xiàn)有逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的嗜對蝦細(xì)胞性方面，我們成功克隆得到了對蝦WSSV兩種囊膜蛋白VP19和VP28的基因編碼框序列，長度分別為366 bp和615 bp，分別編碼121和204個(gè)氨基酸。將其定向插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-HisA，成功構(gòu)建了pcDNA-VP19和pcDNA-VP28兩個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒。通過共轉(zhuǎn)染不同組合的包

9、裝質(zhì)粒與病毒報(bào)告質(zhì)粒到包裝細(xì)胞Plat-GP中:(1)pMCs-PLTR-eGFP和 pCMV-VSV-G;(2) pMCs-PLTR-Pme-tctp-eGFP和pCMV-VSV-G;(3)pMCs-eGFP、pCMV-VSV-G、pcDNA-VP19和pcDNA-VP28;(4)pMCs-PLTR-Pme-tctp-eGFP、pCMV-VSV-G、pcDNA-VP19和PcDNA-VP28,進(jìn)行病毒包裝、滴度測定和對蝦原代培養(yǎng)細(xì)胞感

10、染，以比較該系統(tǒng)的嗜對蝦細(xì)胞性上的變化。結(jié)果表明，所包裝病毒的滴度可達(dá)到(1.9-2.1)×108 TU/ml。包裝病毒侵染對蝦原代培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)后，沒有共轉(zhuǎn)染對蝦WSSV囊膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-VP19和pcDNA-VP28的包裝病毒顆粒以及單啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體所包裝的病毒顆粒所感染對蝦細(xì)胞中均未觀察到綠色熒光表達(dá)。只有共轉(zhuǎn)染組合(4)包裝而形成的病毒顆粒，才能成功介導(dǎo)報(bào)告基因在對蝦原代培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)，雖然只檢測到較少的陽性克

11、隆，且熒光強(qiáng)度較弱，但這一結(jié)果表明，將對蝦WSSV囊膜蛋白VP28和VP19引入逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)可明顯提高該系統(tǒng)的嗜對蝦細(xì)胞性，雖然效率不高。
　　為了探討對蝦WSSV囊膜蛋白VP28和VP19在提高逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的嗜對蝦細(xì)胞性上的作用機(jī)理，本文利用DAS、Topred2、Tmpred以及HMMTOP四種軟件對VP19和VP28蛋白的疏水性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)VP19中第36-55和第95-114個(gè)氨基酸之間，VP28中

12、第7-27個(gè)氨基酸之間為可能的跨膜結(jié)構(gòu)域。為驗(yàn)證包裝細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的VP19和VP28蛋白是否能定位于質(zhì)膜上，本文分別將eGFP和mCherry基因定向插入到去終止密碼子的vp19和vp28基因序列的C-端，構(gòu)建了兩種融合蛋白表達(dá)載體:pcDNA-VP19-ΔTAA/eGFP（綠色熒光標(biāo)記VP19蛋白）和pcDNA-VP28-ΔTAA/mCherry（紅色熒光標(biāo)記VP28蛋白）。利用脂質(zhì)體法將以上兩種融合蛋白表達(dá)載體導(dǎo)入Plat-GP細(xì)胞

13、中，過表達(dá)48小時(shí)后，通過激光共聚焦顯微鏡成功觀察到過表達(dá)的VP19和VP28蛋白定位于細(xì)胞膜上。這表明本文改造過的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因表達(dá)系統(tǒng)的嗜對蝦細(xì)胞性與對蝦WSSV囊膜蛋白VP19和VP28的引入有關(guān)。
　　在對蝦早期胚胎的microRNAs挖掘方面，本文又以Illumina平臺(tái)獲得的對蝦早期胚胎轉(zhuǎn)錄組序列為參考，利用BlastN與RNAfold分別進(jìn)行同源比對分析以及二級結(jié)構(gòu)分析，最終獲得了21條保守的miRNAs序列，分別屬

14、于19個(gè)miRNAs家族，分別為mja-miR-14、44、242、287、317、927、966、969、1014、1175、2491、2731、2774、2788、3338、3885、4961、6489和6493。為驗(yàn)證所預(yù)測的對蝦miRNAs的真實(shí)性，并比較其在不同發(fā)育時(shí)期的miRNAs的表達(dá)模式，我們進(jìn)一步通過RT-qPCR技術(shù)分析了這些miRNAs在對蝦原腸胚時(shí)期和無節(jié)幼體時(shí)期的miRNAs表達(dá)模式。發(fā)現(xiàn)，只有其中的15條mi

15、RNAs成功擴(kuò)增得到了陽性條帶;原腸胚時(shí)期的miRNAs表達(dá)水平與無節(jié)幼體時(shí)期呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式;其中mja-miR-3885在兩個(gè)發(fā)育時(shí)期均具有極高的表達(dá)量，表明該miRNAs在對蝦胚胎的發(fā)育過程中具有重要的作用。
　　靶基因預(yù)測結(jié)果表明，以轉(zhuǎn)錄組中所有unigene作為參考數(shù)據(jù)庫，通過miRanda算法和一套嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行預(yù)測和篩選，最終得到了120個(gè)靶基因序列。利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫對所有預(yù)測的靶基因進(jìn)行分析研究，結(jié)果表明

16、所有的靶基因在細(xì)胞組分上分為11個(gè)類別，在分子功能上分為10個(gè)類別，在生物學(xué)功能上分為18個(gè)類別。其中19個(gè)靶基因涉及31個(gè)代謝通路，主要的代謝途徑有:RNA降解途徑、Wnt信號(hào)通路、細(xì)胞周期以及礦物質(zhì)吸收等，這些對胚胎發(fā)育均具有重要作用。在靶基因預(yù)測的過程中，11個(gè)靶基因被注釋與對蝦胚胎的發(fā)育行為和免疫有關(guān)。本文還對其中的七個(gè)基因進(jìn)行了RPKM值統(tǒng)計(jì)以及RT-qPCR表達(dá)豐度分析。上述miRNAs及其靶基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式結(jié)果

17、提示我們，對蝦也具有一個(gè)復(fù)雜的miRNA: mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)用于精準(zhǔn)調(diào)控其胚胎發(fā)育過程。
　　總之，本文對對蝦TCTP基因啟動(dòng)子(Ptctp)和WSSV早期基因ie1啟動(dòng)子(Pie1)在對蝦原代培養(yǎng)細(xì)胞中的活性以及SV40增強(qiáng)子序列在對蝦細(xì)胞中的DTSs活性進(jìn)行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)這兩種啟動(dòng)子均能介導(dǎo)外源基因在對蝦細(xì)胞中的表達(dá)，雖然表達(dá)效率還不高。SV40能夠明顯提高動(dòng)物細(xì)胞中載體的入核效率。本文還在此基礎(chǔ)上建立了一套嗜對蝦細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)