日本囊對蝦MjML基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)是我國四大養(yǎng)殖對蝦品種之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。日本囊對蝦幼體發(fā)育過程復(fù)雜，受精卵孵化后需要經(jīng)過無節(jié)幼體，溞狀幼體，糠蝦幼體和仔蝦4個發(fā)育階段，發(fā)育過程中蛻皮頻繁，蛻皮周期較短。近年來，隨著日本囊對蝦養(yǎng)殖規(guī)模的逐步擴(kuò)大，各種細(xì)菌性疾病對其養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成了巨大的影響，并造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　ML(MD-2-related Lipid-recognition)家族為一類

2、具有保守ML單結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，能夠直接和脂類結(jié)合，從而參與先天免疫和脂類的識別與代謝過程。本研究采用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了日本囊對蝦形態(tài)變異類型Ⅰ的ML基因——MjML。該基因的cDNA全長614bp，開放閱讀框長453bp，編碼150個氨基酸，理論等電點(diǎn)為4.55，相對分子質(zhì)量為15865.23Da。通過基因組PCR擴(kuò)增得到1678bp的MjML的基因組序列，其中含有4個外顯子與3個內(nèi)含子。MjML具有6個在ML蛋白中相對保

3、守的半胱氨酸殘基，可能形成3對二硫鍵。同源性比對發(fā)現(xiàn)，MjML的氨基酸序列與凡納濱對蝦的LvML一致性最高(84.0％)。實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示MjML主要在肝胰腺中表達(dá)，在心臟、血細(xì)胞、肌肉、胃、鰓、神經(jīng)、腸、眼柄中表達(dá)均極微量。在日本囊對蝦早期幼體發(fā)育過程中，MjML表達(dá)量在階段性的蛻皮與變態(tài)后有大幅的升高;在仔蝦期間，MjML表達(dá)量呈現(xiàn)階段上升的特征。
　　為了進(jìn)一步研究MjML基因的相關(guān)功能，本研究根據(jù)已獲得的MjML

4、的cDNA序列構(gòu)建重組pET-28a-MjML質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá)，并通過Western Blot確定為帶6×His標(biāo)簽的重組MjML蛋白。MjML蛋白最佳誘導(dǎo)條件為:IPTG濃度0.1mmol/L，30℃220rpm，誘導(dǎo)培養(yǎng)6h，且重組蛋白主要以不可溶的包涵體形式存在。收集包涵體，經(jīng)過尿素溶解變性、梯度透析法復(fù)性、過Ni柱純化和脫鹽后，得到濃度為1.02mg/mL的可溶性重組蛋白。LPS(lipopolysaccharide，細(xì)菌脂多糖