日本對(duì)蝦免疫相關(guān)基因QM的功能研究.pdf

1、對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)是危害養(yǎng)殖對(duì)蝦的最主要病原，其致病能力強(qiáng)，傳播范圍廣，給世界對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失，然而至今仍無有效的防治方法。要進(jìn)行病害的有效防治，必須了解對(duì)蝦免疫的機(jī)理。本論文首先利用WSSV建立對(duì)蝦病毒基因功能研究的RNAi技術(shù)，在此基礎(chǔ)上開展對(duì)蝦QM蛋白在對(duì)蝦免疫過程中的作用研究，為建立有效的對(duì)蝦病害防治方法提供科學(xué)依據(jù)。 采用RNAi方法，選擇在WSSV的感染中起重要作用的vp28基因(編碼WSSV主

2、要的膜蛋白)作為干擾目的基因，在體外合成siRNA后，利用體外注射的方法進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)vp28基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)被序列特異的siRNA干擾抑制，此時(shí)用競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)vp28進(jìn)行干擾后，顯著降低對(duì)蝦體內(nèi)的病毒粒子拷貝數(shù)，同時(shí)能延緩對(duì)蝦的死亡。因此，在WSSV中建立了基因功能研究的：RNAi方法。在重復(fù)注射3次siRNA后，對(duì)蝦體內(nèi)WSSV被完全清除，說明RNAi在對(duì)蝦體內(nèi)具有抗病毒效果，這為對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV

3、)的防治提供一種新的有效方法。 通過RACE等得到對(duì)蝦QM基因(PiQM)，序列分析發(fā)現(xiàn)，PJQM具備QM蛋白的基本特征和功能結(jié)構(gòu)域。對(duì)該基因進(jìn)行了原核表達(dá)，并純化得到融合蛋白。RT-PCR和Western blot分析發(fā)現(xiàn)，PjQM在對(duì)蝦各組織中均有轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。Real-time PCR分析發(fā)現(xiàn)，在受到病毒刺激后PjQM基因表達(dá)上調(diào)，說明PjQM參與了對(duì)蝦的免疫過程。通過GST下拉、質(zhì)譜鑒定等分析發(fā)現(xiàn)，PjQM蛋白與血藍(lán)蛋白、

4、肌球蛋白(myosin)之間存在相互作用，進(jìn)一步的體外和體內(nèi)試驗(yàn)證明，PjQM與血藍(lán)蛋白之間確實(shí)存在互作。蛋白質(zhì)互作提示，PjQM可能通過酚氧化酶激活系統(tǒng)等途徑參與對(duì)蝦免疫。采用上述在WSSV基因功能研究中建立的RNAi技術(shù)，研究PjQM的功能。Northern blot和Western blot結(jié)果顯示，PjQM基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)被PjQM序列特異的siRNA抑制，此時(shí)對(duì)蝦酚氧化酶(PO)活性顯著下降。因此，RNAi試驗(yàn)結(jié)果表明，QM可