中華鱉部分免疫相關(guān)基因克隆及其功能研究.pdf

1、中華鱉屬于古老的次生水生爬行動(dòng)物，作為變溫羊膜腔動(dòng)物向恒溫動(dòng)物羊膜腔進(jìn)化的聯(lián)結(jié)點(diǎn)，不僅在生命科學(xué)研究、野生資源保護(hù)等方面具有重要的科研價(jià)值;而且中華鱉具有較高的食用和藥用價(jià)值，已成為我國(guó)及東南亞某些地區(qū)的主要特種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。然而，由于品種退化、病害嚴(yán)重以及基礎(chǔ)研究薄弱等問題，嚴(yán)重影響中華鱉研究和養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本研究通過對(duì)中華鱉免疫相關(guān)基因的克隆和功能分析，旨在探明中華鱉天然免疫應(yīng)答、應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)制，為深入開展中華鱉免疫學(xué)、系

2、統(tǒng)發(fā)育以及病原與機(jī)體互作研究等奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 1.中華鱉tMyD88全長(zhǎng)cDNA克隆及其組織表達(dá)差異分析
　　 MyD88是啟動(dòng)先天免疫的主要接頭分子之一，本試驗(yàn)首次獲得爬行動(dòng)物屬的中華鱉MyD88(tMyD88)全長(zhǎng)cDNA。經(jīng)序列分析，全長(zhǎng)tMyD88 cDNA ORF為894-bp，編碼297個(gè)氨基酸，N-端和C-端分別具有典型的DD結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)和保守的TIR結(jié)構(gòu)域(Toll/

3、IL-1R domain)。熒光定量RT-PCR檢測(cè)中華鱉經(jīng)嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)攻毒后不同臟器中tMyD88 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平由高到低為，脾臟＞血液＞肺臟＞肝臟＞腎臟＞小腸＞心臟＞肌肉。RAW264.7細(xì)胞經(jīng)pcDNA-tMyD88轉(zhuǎn)染后，NF-κB活性顯著高于對(duì)照組(673.8 vs410.7，P＜0.05)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液中IL-1β和TNF-α含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。結(jié)果表明，獲

4、得的中華鱉tMyD88全長(zhǎng)cDNA分子具有與哺乳動(dòng)物類似的生物學(xué)活性，可能在中華鱉抗感染免疫中具有重要的作用。
　　 2.中華鱉熱休克蛋白基因tHsc70、tGRP78和tHsp72鑒定及熱應(yīng)激對(duì)其表達(dá)的影響
　　 Hsp70s(70kDa heat shock proteins)作為分子伴侶，不僅參與機(jī)體的蛋白質(zhì)折疊、運(yùn)輸，而且可能介導(dǎo)機(jī)體免疫。本試驗(yàn)克隆和鑒定了中華鱉熱休克蛋白基因tHsc70、tGRP78和tHsp

5、72。tHsc70全長(zhǎng)cDNA ORF為1941-bp，編碼647個(gè)氨基酸，與脊椎動(dòng)物Hsc70(heat shock cognate protein70)分子在核苷酸和氨基酸同源性分別在80-87.7％和95.5-99.5％;tGRP78 cDNA全長(zhǎng)ORF為1980-bp，編碼660個(gè)氨基酸，與脊椎動(dòng)物的GRP78(glucose regulated protein78)分子在核苷酸和氨基酸同源性分別在79.3-80.3％和92.3

6、-94％;tHsp72全長(zhǎng)cDNA ORF為1908-bp，編碼636個(gè)氨基酸，與脊椎動(dòng)物的Hsp72(inducible heat shock protein70)分子在核苷酸和氨基酸同源性分別在72-76.5％和83.6-89.1％。三個(gè)中華鱉熱休克蛋白70分子均具有ATPase結(jié)合結(jié)構(gòu)域、底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域、ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)基序(AEAYLGRKK)、Hsp70s家族的三個(gè)特征性的序列標(biāo)簽(IDLGTTYS，IFDLGGGTFD

7、VSIL，IVLVGGSTRIPKIQ)以及胞質(zhì)(EEVD)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(KDEL)一致性序列。Western-blotting分析表明，原核表達(dá)純化的tHsc70和tHsp72個(gè)熱休克蛋白可與特異性的單/多克隆抗體反應(yīng)。分子進(jìn)化分析表明，三個(gè)中華鱉熱休克蛋白70分子與美洲鱷(Alligator mississippiensis)和禽類(Gallus gallus)在同一群內(nèi)，具有較近的親緣關(guān)系。中華鱉熱激(40℃)后，與對(duì)照組(25℃)相

8、比，四個(gè)組織中的tHsc70、tGRP78和tHsp72的mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)不同程度的變化。中華鱉在熱激1-4hrs后肝臟、心臟、肺臟和肌肉四個(gè)組織的tHsc70 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)0.25至20.35倍不等的上升，尤其經(jīng)4 hrs熱激的中華鱉肝臟組織上升最顯著，為對(duì)照組的20.35倍(P＜0.01）。4 hrs應(yīng)激組中華鱉肝臟中tGRP78 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比增加最明顯，約為1.86倍(P＜0.05）。但肝臟中t

9、Hsp72的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平在2hrs熱激后到達(dá)峰值，約為對(duì)照組的4.66倍（P＜0.05），隨后出現(xiàn)輕微下降。Westernblotting分析，中華鱉2hrs和4hrs熱激以及熱激1h、2 hrs和4hrs結(jié)合恢復(fù)1h時(shí)肝臟中tHsc70蛋白相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）;熱激1h、2hrs和4hrs后肝臟中tGRP78蛋白相對(duì)表達(dá)比對(duì)照組均有顯著升高（P＜0.05）。上述結(jié)果顯示，克隆的3個(gè)分子為中華鱉熱休克蛋白7

10、0，具有較高的保守性;中華鱉熱激后，不同組織的熱休克蛋白70存在不同的表達(dá)模式，可能與細(xì)胞保護(hù)等有關(guān)。
　　 3.病原相關(guān)模式分子對(duì)中華鱉Toll樣受體及其免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　 從中華鱉脾臟中PCR擴(kuò)增出tlr2(1112bp)、tlr3(565bp)、tlr4(990bp)和il-1β(159bp)的cDNA部分序列。中華鱉TLR2測(cè)序后經(jīng)序列比較和結(jié)構(gòu)域分析顯示，該序列與斑馬魚、雞等脊椎動(dòng)物的TLR2序列同源

11、性和相似性分別為60.8-74.4％和58.6-76％，該片段包含富亮氨酸重復(fù)C端結(jié)構(gòu)域(Leucine rich repeatC-terminal domain，LRRCT)(aa1-47),跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane domain)(aa49-71)和TIR結(jié)構(gòu)域(Toll-like/IL-1 receptor domain)(aa101-244)。中華鱉TLR3與其他脊椎動(dòng)物的TLR3序列同源性和相似性分別為58-81

12、.2％和51.9-76.1％，包含跨膜結(jié)構(gòu)域(aa10-32)和TIR結(jié)構(gòu)域(aa62-188)。中華鱉TLR4與其他脊椎動(dòng)物的相應(yīng)分子的序列同源性和相似性分別為48.5-67.4％和38.2-63％，包含連續(xù)的3個(gè)LRR(aa23-46，47-70，71-94)，LRRCT(aa107-157)，跨膜結(jié)構(gòu)域(aa171-193)和TIR結(jié)構(gòu)域(aa206-330)。中華鱉IL-1β經(jīng)BlastP分析顯示其與雞IL-1β(aa66-11

13、8)之間相似性達(dá)到60.4％，與其他脊椎動(dòng)物的IL-1β序列同源性和相似性分別為49.7-61.4％和28.3-49.1％。用代表性病原相關(guān)模式分子(pathogen associated molecular pattern，PAMP)不同濃度對(duì)中華鱉外周血細(xì)胞TLRs等相關(guān)免疫分子表達(dá)影響的分析表明，中華鱉外周血細(xì)胞經(jīng)4000ng/mL Zymosan刺激2 hrs后tlr2 mRNA的表達(dá)水平較高，il-1β mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

14、隨著刺激濃度的提高而增加。Poly(I∶C)濃度在40-8000 ng/mL之間，tlr3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平隨著Poly(I∶C)濃度的增加出現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。28℃條件下，Poly(I∶C)低濃度(40ng/mL)和高濃度(4000ng/mL)刺激均能使tHsp72 mRNA轉(zhuǎn)錄水平提高;LPS刺激后，tlr4、tMyD88和il-1β mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平隨著濃度的提高而增加。37℃條件下，Poly(I∶C)刺激組的tlr3

15、基因表達(dá)比28℃組高1.46倍。上述結(jié)果初步表明，中華鱉Toll樣受體、MyD88、Hsp70s和il-1β對(duì)部分PAMP分子刺激具有不同程度的響應(yīng)性。
　　 綜上所述，本研究首次克隆和鑒別了中華鱉tMyD88、tHsc70、tGRP78和tHsp72全長(zhǎng)cDNA分子以及tlr2、tlr3、tlr4和il-1βcDNA部分序列，8個(gè)克隆的中華鱉分子均與禽類和爬行類的相應(yīng)分子位于同一個(gè)姐妹群，而與哺乳動(dòng)物、兩棲類和魚類等其他物種處