中華鱉腎組織的比較細(xì)胞學(xué)研究及其ACE2的分布與基因克隆.pdf

1、腎臟是脊椎動(dòng)物最主要的排泄器官,生命活動(dòng)中產(chǎn)生的代謝廢物和多余的水分,以尿液的形式通過(guò)腎臟排出,對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)體的水鹽代謝和離子平衡具有重要作用。另一方面,腎臟還具有產(chǎn)生多種激素和生物活性物質(zhì)的功能。因此,其機(jī)能的正常與否直接關(guān)系到動(dòng)物的健康。爬行動(dòng)物處于動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中的特殊地位,其腎臟是后腎的開(kāi)端,屬于脊椎動(dòng)物腎臟發(fā)育的第五種類型。中華鱉(Pelodiseus sinensis)生活在潮濕的近水源處,機(jī)體對(duì)水的需求較高,其腎臟在機(jī)體保水上發(fā)

2、揮重要作用。為了闡明中華鱉腎組織的細(xì)胞學(xué)特征,選擇具有明顯耐旱性的雙峰駝(Camelus bactrianus)進(jìn)行比較研究。與中華鱉棲息地環(huán)境截然相反,雙峰駝生活在干旱的荒漠地區(qū),長(zhǎng)期缺水的情況下,仍然能夠生存,這與其腎臟的保水功能有關(guān)。腎臟通過(guò)減少尿液排泄量達(dá)到保水的目的,而如何減少尿液量就顯得尤為重要。
　　 本研究首先從中華鱉腎臟泌尿小管的分布規(guī)律及細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)入手,深入了解腎臟形態(tài)與其功能的聯(lián)系,進(jìn)一步應(yīng)用細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)

3、,探究了四種酶和兩種活性物質(zhì)在中華鱉腎組織中的分布規(guī)律,在光鏡和電鏡下分析了腎組織微細(xì)結(jié)構(gòu)的性別差異。在此基礎(chǔ)上,闡明了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)在中華鱉腎臟的分布特點(diǎn),首次克隆并鑒定了爬行動(dòng)物腎組織ACE2基因,分析并討論了ACE2對(duì)腎臟局部腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的作用機(jī)制。為了探索中華鱉腎組織的細(xì)胞學(xué)特性,本文還對(duì)生活于干旱環(huán)境的雙峰駝的腎組織進(jìn)行了比較研究。研究結(jié)果在細(xì)胞和分子水平上明確了中華鱉腎組織的微細(xì)特征和細(xì)胞組成

4、及其ACE2的分布與基因克隆,分析了這些特征的機(jī)能意義,為中華鱉養(yǎng)殖、保護(hù)及資源利用等研究奠定基礎(chǔ)。
　　 試驗(yàn)Ⅰ中華鱉腎臟的比較組織學(xué)研究對(duì)中華鱉腎臟進(jìn)行了詳細(xì)的光鏡觀察和結(jié)構(gòu)參數(shù)測(cè)定及繪制出腎單位分布模式圖,并與雙峰駝腎組織進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,中華鱉腎臟由5-6個(gè)腎葉組成,腎葉包括被膜和實(shí)質(zhì)兩部分。實(shí)質(zhì)無(wú)皮質(zhì)與髓質(zhì)之分,而是分為外周區(qū)和中間區(qū),外周區(qū)與中間區(qū)厚度比約為3:1。腎單位無(wú)髓袢和球旁復(fù)合體結(jié)構(gòu),但可以區(qū)分為腎小體

5、、頸段(或缺失)、近端小管、中間段、遠(yuǎn)端小管和集合管六部分。外周區(qū)主要分布有近端小管、集合管和大部分中間段。中間區(qū)主要分布有腎小體、小部分中間段和大部分遠(yuǎn)端小管。鱉腎小體平均直徑約為120μm,在中間區(qū)的小葉內(nèi)靜脈兩側(cè)呈單個(gè)分散或2-4個(gè)聚集分布。頸段很短或缺失,細(xì)胞呈矮立方形,管腔狹窄。近端小管細(xì)胞呈柱狀或錐體形,細(xì)胞高度約為20μm,胞質(zhì)嗜酸性,腔面刷狀緣明顯,上皮由弱嗜伊紅的亮細(xì)胞和嗜伊紅的暗細(xì)胞組成。近端小管外徑為60μm,長(zhǎng)度

6、最長(zhǎng),且呈高度盤(pán)曲狀。中間段細(xì)胞呈矮立方形,細(xì)胞高度約為9μm,胞質(zhì)少,胞核占大部分。中間段外徑為26μm,在與近端小管過(guò)渡的部位,胞核呈密集排列,胞質(zhì)呈弱嗜酸性。遠(yuǎn)端小管細(xì)胞呈立方形,管徑粗細(xì)和細(xì)胞大小不一,細(xì)胞平均高度約為12μm,平均管徑為37μm,細(xì)胞核排列不均勻,胞質(zhì)弱嗜酸性,其長(zhǎng)度僅小于近端小管。集合管管腔最大,外徑為65μm。細(xì)胞呈柱狀,高度約為17μm,胞質(zhì)弱嗜酸性,位于外周區(qū)的近端小管之間,呈稍彎曲狀。小葉內(nèi)靜脈和動(dòng)脈

7、分布在中間區(qū)的中央。腎間質(zhì)少,腎小管之間幾乎全部為毛細(xì)血管。中華鱉腎單位的分布規(guī)律和組成與爬行類的蜥蜴、短吻鱷等不完全相同,與哺乳類雙峰駝的差異則更明顯。雙峰駝腎臟實(shí)質(zhì)分為薄的皮質(zhì)和寬厚的髓質(zhì),髓質(zhì)與皮質(zhì)厚度比為4:1。腎小體很大,平均直徑約為220μm。長(zhǎng)袢型中間腎單位和髓旁腎單位比短袢型淺表腎單位多。皮質(zhì)迷路內(nèi)近曲小管遠(yuǎn)長(zhǎng)于遠(yuǎn)曲小管。髓質(zhì)外髓的直小血管形成發(fā)達(dá)的血管束,與泌尿小管束相間排列。內(nèi)髓比外髓厚,外髓有次級(jí)。腎錐體出現(xiàn)。雙峰

8、駝腎臟結(jié)構(gòu)與其具有高濃縮尿液能力相一致。以上結(jié)果為爬行類腎單位研究及雙峰駝腎單位結(jié)構(gòu)與尿液濃縮能力的關(guān)系研究提供了形態(tài)學(xué)資料,同時(shí)亦為動(dòng)物腎臟生理研究提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。
　　 試驗(yàn)Ⅱ中華鱉腎單位超微結(jié)構(gòu)的比較細(xì)胞學(xué)研究本試驗(yàn)利用光鏡、透射電鏡和掃描電鏡對(duì)中華鱉腎單位超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,并與雙峰駝腎組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,中華鱉腎小囊壁層上皮細(xì)胞間含有側(cè).基底細(xì)胞間隙,并有指狀突起分布。臟層足細(xì)胞中含有少量線粒體、豐富的粗

9、面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及許多核糖體,這些細(xì)胞器一直伴隨突起分布到末端的足突,并可見(jiàn)寬大的足突附著在血管球基底膜上。由足細(xì)胞胞體發(fā)出寬大的初級(jí)突起,初級(jí)突起又發(fā)出多條寬窄不一的次級(jí)突起,次級(jí)突起再發(fā)出細(xì)小而密集的三級(jí)突起。這些結(jié)構(gòu)最終形成由一個(gè)足細(xì)胞的突起伸向幾條毛細(xì)血管并通過(guò)末端的足突附著于毛細(xì)血管基膜上的特殊結(jié)構(gòu)。足細(xì)胞的這種形態(tài)在其它脊椎動(dòng)物腎臟研究中未見(jiàn)報(bào)道。血管球基底膜較厚,為300-600nm,內(nèi)皮孔孔徑約為80-185nm,數(shù)量少,且呈區(qū)

10、域性分布。中華鱉腎小球?yàn)V過(guò)屏障的形態(tài)特征可能與爬行動(dòng)物具有很低的血管球?yàn)V過(guò)率相一致。近端小管微絨毛密集而長(zhǎng),頂端胞質(zhì)含有發(fā)達(dá)的胞吞溶酶體結(jié)構(gòu),為尿液重吸收的主要部位；中間段上皮細(xì)胞由多纖毛細(xì)胞和非纖毛細(xì)胞組成,其主要作用為推送尿液向遠(yuǎn)端小管的運(yùn)輸；遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞具有發(fā)達(dá)的側(cè)指狀鑲嵌內(nèi)褶和基底質(zhì)膜內(nèi)褶,為物質(zhì)運(yùn)輸活躍的部位；集合管上皮申的亮細(xì)胞的頂端胞質(zhì)含有許多黏液分泌顆粒,細(xì)胞核附近有同心圓形的高爾基體,而在暗細(xì)胞中有大量電子密度致密

11、的具板層狀嵴的線粒體。另外,集合管上皮細(xì)胞之間含有細(xì)胞間隙,間隙內(nèi)布滿了指狀突起。集合管亮細(xì)胞分泌的黏液可以與管腔中的尿酸鹽結(jié)合而形成屏障,以阻止細(xì)胞內(nèi)水分進(jìn)入管腔,起到保水的作用。
　　 與中華鱉腎臟明顯不同,雙峰駝足細(xì)胞中含有豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,且微絲、微管亦發(fā)達(dá)。足細(xì)胞初級(jí)突起寬大,次級(jí)突起較短,由次級(jí)突起末端形成的足突密集附著于血管球基底膜。近端小管胞質(zhì)頂端含有豐富的管泡結(jié)構(gòu),腔面微絨毛粗大、呈高而密集的

12、分布,有些微絨毛頂端形成空泡狀。遠(yuǎn)端小管腔面微絨毛短而稀少,胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富,質(zhì)膜內(nèi)褶發(fā)達(dá)。集合小管亮細(xì)胞數(shù)量多,線粒體少,而暗細(xì)胞中線粒體豐富。雙峰駝腎單位的形態(tài)特點(diǎn)與其具有強(qiáng)大的尿液濃縮能力相符。本研究揭示了中華鱉腎單位的微細(xì)結(jié)構(gòu),并與雙峰駝進(jìn)行了比較,表明中華鱉具有很低的腎小球?yàn)V過(guò)率,其近端小管在尿液重吸收上發(fā)揮重要作用。中華鱉腎單位細(xì)胞結(jié)構(gòu)與其它爬行動(dòng)物存在一定差異,而與雙峰駝的差異明顯。
　　 試驗(yàn)Ⅲ中華鱉腎組織微細(xì)結(jié)

13、構(gòu)的性別差異利用甲苯胺蘭半薄切片和透射電鏡超薄切片對(duì)雌、雄中華鱉腎組織的微細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明,雌、雄中華鱉的近端小管、中間段上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在一定差異。雄鱉的近端小管細(xì)胞之間含有側(cè)-基底細(xì)胞間隙,側(cè)細(xì)胞間隙內(nèi)分布有指狀突起,而細(xì)胞基底部與基膜之間形成基底間隙與迷路。雌鱉近端小管上皮無(wú)細(xì)胞間隙。雌、雄鱉中間段相鄰細(xì)胞也表現(xiàn)出相似的形態(tài)差異。側(cè)細(xì)胞間隙僅存在于雄性中間段上皮,間隙內(nèi)分布有細(xì)長(zhǎng)的指狀突起,而在雌性中間段上皮中無(wú)細(xì)胞間

14、隙。在雄性中華鱉近端小管上皮中含有三種細(xì)胞:主細(xì)胞、禿頭細(xì)胞和基底細(xì)胞,與之不同,雌鱉的近端小管上皮則含有亮、暗兩種上皮細(xì)胞。
　　 曾有人報(bào)道蛇與蜥蜴的腎臟中分布有性段結(jié)構(gòu),性段為雄性腎單位遠(yuǎn)端的膨大部位,其分泌物具有與生殖活動(dòng)有關(guān)的功能。本研究在中華鱉腎臟未觀察到性段結(jié)構(gòu),但首次發(fā)現(xiàn)雌、雄腎組織的近端小管和中間段的微細(xì)結(jié)構(gòu)存在性別差異。這種差異是否與性段具有相似的生物學(xué)功能,還需要進(jìn)一步生理學(xué)研究。但雄性近端小管上皮細(xì)胞之間

15、存在明顯的間隙應(yīng)與物質(zhì)運(yùn)輸有關(guān),提示,雄性近端小管上皮的重吸收能力可能較雌性強(qiáng)。
　　 試驗(yàn)Ⅳ中華鱉腎組織的細(xì)胞化學(xué)特性利用光鏡細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)四種酶及兩種活性物質(zhì)在中華鱉腎單位的分布特性進(jìn)行了詳細(xì)地分析與研究。結(jié)果表明,各種酶及活性物質(zhì)在腎單位中的分布不盡相同,表現(xiàn)出分布部位及反應(yīng)強(qiáng)弱的不同。琥珀酸脫氫酶(SDH)為細(xì)胞內(nèi)線粒體的標(biāo)志酶,其主要分布在中間段、遠(yuǎn)端小管和集合管上皮細(xì)胞中,而在腎小球、近端小管中的反應(yīng)較弱。堿性磷酸酶

16、(ALPase)存在于物質(zhì)交換活躍的部位,主要分布在近端小管刷狀緣。ATPase在離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及膜電位的調(diào)節(jié)方面起著關(guān)鍵作用,主要分布在近端小管刷狀緣,而在中間段腔面為弱陽(yáng)性。酸性磷酸酶(ACPase)作為溶酶體的標(biāo)志酶,參與胞內(nèi)磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝,其反應(yīng)在近端小管刷狀緣為強(qiáng)陽(yáng)性,在腎小球足細(xì)胞處呈陽(yáng)性。集合管胞質(zhì)內(nèi)含有大量ACPase陽(yáng)性顆粒。PAS反應(yīng)用來(lái)鑒定碳水化合物和大分子的糖結(jié)合物,在中華鱉腎臟中的分布范圍廣泛,主要分布于

17、腎小球、近端小管、集合管的上皮細(xì)胞及所有腎小管的基底膜。集合管腔面顯示PAS強(qiáng)陽(yáng)性,血管球、遠(yuǎn)端小管細(xì)胞側(cè)面、近端小管刷狀緣為陽(yáng)性,其它部位反應(yīng)較弱。阿利新蘭(AB)標(biāo)記酸性粘蛋白,其主要分布于遠(yuǎn)端小管和集合管的腔面。甲苯胺蘭(TB)反應(yīng)顯示了近端小管、中間段和集合管上皮中的亮、暗細(xì)胞。上述細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)結(jié)果表明,腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞含有豐富的糖原,為血管球?yàn)V過(guò)原尿的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量,而臟層足細(xì)胞具有磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)運(yùn)能力；在近端小管上皮組

18、織的原位顯示了幾種與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的活性成分,表明中華鱉近端小管在原尿重吸收中起主要作用；遠(yuǎn)端小管和集合管細(xì)胞代謝旺盛,細(xì)胞腔面分泌的黏液物質(zhì)可以潤(rùn)滑管腔,起到保水的作用。中間段代謝活動(dòng)強(qiáng),有利于纖毛向后段腎小管推送尿液；研究還表明中華鱉腎小管細(xì)胞類型較多。中華鱉腎單位的細(xì)胞化學(xué)特性不僅與哺乳類和鳥(niǎo)類有一定差異,也與其它爬行動(dòng)物不完全相同。
　　 試驗(yàn)V中華鱉腎組織ACE2的免疫細(xì)胞化學(xué)研究采用免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)研究了血管緊張素轉(zhuǎn)換

19、酶2(angiotensin-converting enzyme2,ACE2)在中華鱉腎臟中的分布及特點(diǎn),并與雙峰駝進(jìn)行比較。結(jié)果首次顯示,ACE2在爬行類腎臟中有分布,進(jìn)一步證明特異性ACE2陽(yáng)性反應(yīng)見(jiàn)于中華鱉腎臟近端小管、足細(xì)胞、血管球基底膜和小葉內(nèi)靜脈內(nèi)皮,而中間段、遠(yuǎn)端小管和集合管上皮弱陽(yáng)性。ACE2在中華鱉腎單位不同部位的分布表明,其主要在腎小球和近端小管調(diào)節(jié)原尿的濾過(guò)及重吸收。與之相比,雙峰駝腎臟ACE2在皮質(zhì)部的分布比髓質(zhì)

20、部廣泛,皮質(zhì)部腎小球系膜細(xì)胞、近曲小管和集合小管為陽(yáng)性,而遠(yuǎn)曲小管弱陽(yáng)性。近直小管為陽(yáng)性,遠(yuǎn)直小管弱陽(yáng)性。髓質(zhì)部集合小管、乳頭管上皮為陽(yáng)性,而細(xì)段和直小血管為陰性。這些結(jié)果表明ACE2在哺乳動(dòng)物雙峰駝腎臟中的分布比中華鱉更廣泛。ACE2通過(guò)調(diào)節(jié)腎臟腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS),影響腎臟的血流量,進(jìn)而調(diào)節(jié)水鹽代謝,而廣泛分布的ACE2可能與雙峰駝具有強(qiáng)大的尿液濃縮能力有關(guān)。
　　 試驗(yàn)Ⅵ中華鱉腎臟ACE2基因克隆及其遺傳進(jìn)化分析

21、本研究從中華鱉腎臟組織中克隆ACE2基因,進(jìn)一步確定ACE2在中華鱉。腎臟中的存在,為下一步研究其功能提供分子基礎(chǔ)。從中華鱉腎臟中提取總RNA,以O(shè)ligo dT-Adaptor為引物合成cDNA。根據(jù)人、斑馬魚(yú)、雞的ACE2基因mRNA保守序列設(shè)計(jì)引物,通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),擴(kuò)增出中華鱉ACE2基因的部分序列并進(jìn)行序列分析。結(jié)果顯示:克隆的這段中華鱉ACE2序列長(zhǎng)度為355bp,并已將該基因序列提交到GenBank,登錄號(hào)為:HM107