牽張力調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)的分子機(jī)制及其介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、第一部分：牽張力介導(dǎo)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2的表達(dá)及其對(duì)平滑肌細(xì)胞功能影響的研究
　　 血管重構(gòu)被公認(rèn)為高血壓、冠心病等心血管疾病的重要病理特點(diǎn)，它是指血管管腔面積及形態(tài)、管壁結(jié)構(gòu)和成分、血管功能的慢性改變。機(jī)械性損傷、炎癥、低氧、血流動(dòng)力學(xué)異常等多種因素均參與血管重構(gòu)的形成。由于血管一直暴露于血流動(dòng)力學(xué)的作用中，異常的血液流體力學(xué)在血管重構(gòu)中的作用及其分子機(jī)制，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者越來(lái)越多的關(guān)注。深入研究血管重構(gòu)的分子機(jī)制，確定在這一過(guò)程

2、中發(fā)揮重要作用的分子和潛在藥物靶點(diǎn)，對(duì)于預(yù)防和減少心血管疾病的死亡率具有重大意義。
　　 人體血管長(zhǎng)期暴露于搏動(dòng)性血流的沖擊下，主要承受著兩種形式的生物力，一種是平行于血管長(zhǎng)軸的剪切力(shearstress)，主要作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞;另一種是垂直于血管長(zhǎng)軸的牽張力(stretchstress)，可影響血管壁各種細(xì)胞成分，但位于管壁中層的平滑肌細(xì)胞是其主要靶細(xì)胞。兩種生物力對(duì)于血管功能的調(diào)節(jié)均具有重要作用。研究認(rèn)為，平滑肌細(xì)胞受

3、到牽張力的刺激時(shí)，其胞膜表面的各種受體分子、離子通道等將膜外機(jī)械性的刺激信號(hào)轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)的生物信號(hào)，激活一系列胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)影響相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、分化等生物學(xué)功能。
　　 腎素-血管緊張素（RAS）系統(tǒng)是影響血管形態(tài)與功能的重要因素。由血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)催化產(chǎn)生的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子，它在心血管重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。AngⅡ不僅具有直接刺激平滑肌細(xì)胞增

4、殖、遷移等功能改變的作用，還介導(dǎo)牽張力對(duì)平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響與相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。在體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中，牽張力刺激能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分泌AngⅡ，而且不依賴于AngⅡ而上調(diào)腎素、ACE、AT1R、AT2R等基因的表達(dá)，而在心肌成纖維細(xì)胞中則沒(méi)有上述作用，這說(shuō)明牽張力本身具有獨(dú)立調(diào)控局部RAS系統(tǒng)基因表達(dá)的作用，而且具有一定的細(xì)胞特異性。新近的研究也表明是組織局部RAS，而不是循環(huán)RAS和炎癥因子，對(duì)高血

5、壓性心血管重構(gòu)起著重要作用。因此，進(jìn)一步探索血管局部RAS系統(tǒng)在牽張力介導(dǎo)的血管生物學(xué)功能中的作用及其機(jī)制具有重要的臨床意義。
　　 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的RAS系統(tǒng)成員，對(duì)其生物學(xué)功能的研究成為近年來(lái)的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，ACE2具有降解AngⅡ生成血管緊張素1-7(Ang-1-7)的作用，后者通過(guò)其特異的Mas受體，拮抗ACE-AngⅡ信號(hào)通路的不良生物學(xué)作用，其被認(rèn)為是RAS系統(tǒng)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，也是參與心

6、血管重構(gòu)的重要分子。此外，如RAS系統(tǒng)其它組分一樣，實(shí)驗(yàn)證實(shí)生物力學(xué)因素也可以調(diào)節(jié)ACE2的表達(dá)。ACE2在血管內(nèi)皮細(xì)胞及動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中均有表達(dá)，其組織特異性表達(dá)及其對(duì)關(guān)鍵血管活性肽AngⅡ獨(dú)特的分解能力，提示它在血管局部RAS中扮演重要角色。與RAS系統(tǒng)的ACE/AngⅡ/AT1R軸相比，ACE2與生物力學(xué)的關(guān)系目前還知之甚少。由于ACE2在心血管重構(gòu)中的保護(hù)作用及其對(duì)心血管細(xì)胞增殖、遷移、膠原代謝等生物學(xué)功能的影響，我們推測(cè)其在牽

7、張力調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用。
　　 基于近年來(lái)的研究對(duì)ACE2在血管平滑肌細(xì)胞功能中作用的闡述，以及牽張力調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞功能的重要性，我們特提出以下科學(xué)假說(shuō):(1)牽張力調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞ACE2的表達(dá)，不同強(qiáng)度的牽張力對(duì)ACE2表達(dá)的影響不同;(2)牽張力影響包括ACE2在內(nèi)的RAS系統(tǒng)各主要成分的表達(dá)，ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸與ACE-AngⅡ-AT1R軸在牽張力作用下，相互對(duì)抗、相互影響，參與不同大

8、小牽張力對(duì)平滑肌細(xì)胞生物學(xué)作用的影響。
　　 研究目的：
　　 1.在體外細(xì)胞研究中，明確牽張力對(duì)血管平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)及活性的影響。
　　 2.明確ACE2在牽張力調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用。
　　 3.通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證力學(xué)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)的影響。
　　 研究方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)及傳代:
　　 培養(yǎng)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后，

9、PBS沖洗細(xì)胞兩遍，以去除血清，加0.25％胰蛋白酶在細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化2分鐘，在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓時(shí)，吸出胰蛋白酶，加入新的完全培養(yǎng)基吹打混勻，轉(zhuǎn)入新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。
　　 2.平滑肌細(xì)胞牽張力干預(yù)分組:
　　 接種平滑肌細(xì)胞至鋪有Ⅰ型膠原的Flexcell六孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90％融合時(shí)，采用無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞靜止24h，然后更換新的完全培養(yǎng)基，利用Flexcell-5000Tension細(xì)胞拉力儀

10、給予細(xì)胞牽張力刺激，具體分組如下:
　　 (1)靜止對(duì)照組:不給予牽張力刺激，其它條件與牽張力干預(yù)組相同;
　　 (2)10％牽張力組:給予最大峰值為10％的周期性牽張力分別刺激細(xì)胞1、3、6、12、24小時(shí)，牽張頻率為1Hz;
　　 (3)15％牽張力組:給予最大峰值為15％的周期性牽張力分別刺激細(xì)胞1、3、6、12、24小時(shí)，牽張頻率為1Hz;
　　 在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，不同強(qiáng)度牽張力干預(yù)平滑肌細(xì)胞結(jié)束后，

11、連同靜止對(duì)照組一起收集細(xì)胞分別提取蛋白與總RNA，-80℃保存待測(cè)血管緊張素Ⅱ(Ang-Ⅱ)及血管緊張素1-7含量（Ang-1-7）。
　　 3.細(xì)胞存活率檢測(cè):
　　 平滑肌細(xì)胞經(jīng)不同強(qiáng)度牽張力刺激12小時(shí)后，胰酶消化的方法收集細(xì)胞，PBS重懸，臺(tái)酚藍(lán)染色液染色5分鐘，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（細(xì)胞總數(shù)-藍(lán)色細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100％。
　　 4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ACE2、ACE

12、、MASmRNA表達(dá):
　　 根據(jù)試劑盒說(shuō)明，用Trizol提取入主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞總RNA，用Takara試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在Bio-Rad公司生產(chǎn)的IQ5上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)量三次。ACE2擴(kuò)增引物序列:上游5’-CATTGGAGCAAGTGTTGGATCTT-3’，下游5'-GAGCTAATGCATGCCATTCTCA-3’;ACE擴(kuò)增引物序列:上游5'-GCGGCTCTTCCAGGAGCTGC-3’，下游5

13、’-CTGCGCCCACATGTTCCCCA-3’;MAS擴(kuò)增引物序列:上游5’-GGCCTCCTCATGGATGGGTCAA-3’，下游5’-GTGCATTCCCGACTGAGGCGT-3’;β-actin擴(kuò)增引物序列，上游5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’，下游5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。反應(yīng)結(jié)束得到Ct值（循環(huán)閾值），用相對(duì)定量的方法計(jì)算2-ΔΔCt，并分析數(shù)據(jù)。ACE2、ACE、MAS

14、mRNA表達(dá)以管家基因β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
　　 5.WesternBlot:
　　 收集細(xì)胞后，提取胞漿胞膜總蛋白，加入蛋白上樣緩沖液，在99℃煮沸10分鐘，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶封閉，用1×TBST洗膜3次。將PVDF膜放入合適比例的一抗中，4℃孵育過(guò)夜，洗膜。合適比例的二抗孵育1小時(shí)，洗膜，最后采用Millipore顯色液進(jìn)行發(fā)光，柯達(dá)膠片顯影完成后觀察結(jié)果。
　　 6.ACE2活性測(cè)定:

15、
　　 各種條件干預(yù)后收集細(xì)胞，提取胞漿蛋白。采用7-Mca-YVADAPK(Dnp)作為反應(yīng)底物，ACE及ACE2都能分解這一底物的2，4-二硝基苯基部分，而2，4-二硝基苯基能夠淬滅7-甲氧基香豆素部分的熒光，它的分解造成熒光增強(qiáng)。20μg的總蛋白提取物與1.0μmol/L7-Mca-YVADAPK(Dnp)混合后室溫下孵育，終容積為100μL。采用酶標(biāo)儀讀取激發(fā)光320nm及散射光400nm的熒光強(qiáng)度，動(dòng)態(tài)讀取熒光值4小時(shí)

16、。ACE2活性定義為:ACE2活性=無(wú)抑制劑時(shí)的熒光強(qiáng)度-ACE2抑制劑DX-600存在時(shí)的熒光強(qiáng)度。每個(gè)樣本測(cè)量三次，最后數(shù)值采用RFU/mg/hour。
　　 7.Ang-(1-7)及AngⅡ產(chǎn)物測(cè)定:
　　 不同水平牽張力干預(yù)平滑肌細(xì)胞后，收集胞漿蛋白，ELISA法檢測(cè)胞漿蛋白中Ang-(1-7)及AngⅡ的含量。
　　 8.細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)ACE2的表達(dá):
　　 HASMCs接種于Flex-50

17、00Tension6孔板中，至細(xì)胞生長(zhǎng)至90％融合時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞靜止24小時(shí)后，分為兩組，即靜態(tài)組、10％牽張力干預(yù)12小時(shí)組。干預(yù)結(jié)束后棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，加入免疫染色固定液固定30min，PBS沖洗，剪下種有細(xì)胞的膜，采用免疫熒光染色，滴加相應(yīng)抗體血清，再滴加1∶200熒光素標(biāo)記的二抗，設(shè)陰性及空白對(duì)照。熒光顯微鏡下觀察、拍片，直觀明確牽張力對(duì)平滑肌細(xì)胞中ACE2的表達(dá)是否有作用。
　　 9.細(xì)胞轉(zhuǎn)染:

18、r>　　 利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染不同濃度的ACE2小干擾RNA(ACE2-siRNA)及陰性對(duì)照小干擾RNA(negativecontrolsiRNA)，ACE2siRNA序列為:Forward5'-CCAUCUACAGUACUGGAAAdTdT-3';Reverse5'-UUUCCAGUACUGUAGAUGGdTdT-3'。negativecontrolsiRNA序列為:Forward5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdt

19、dt-3';Reverse5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdtdt-3，。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞，提取胞漿總蛋白，Westernblot測(cè)定ACE2蛋白表達(dá)以評(píng)價(jià)干擾效果，選取合適的siRNA濃度;按照合適的siRNA濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　 10.ACE2在牽張力調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能中作用的研究
　　 (1)培養(yǎng)HASMCs，給予生理范圍的牽張力(10％elongation，1Hz)刺激12h。

20、>　　 (2)采用Brdu摻入法、細(xì)胞劃痕技術(shù)，明確牽張力對(duì)HASMCs增殖、遷移的影響。
　　 (3)預(yù)先轉(zhuǎn)染ACE2小干擾RNA(siRNA)及其陰性對(duì)照后再給予牽張力干預(yù)，觀察對(duì)上述平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，明確ACE2在牽張力調(diào)節(jié)HASMCs生物學(xué)功能中的作用。
　　 11.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察壓力負(fù)荷改變對(duì)血管平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)的影響
　　 (1)動(dòng)物模型構(gòu)建
　　 20只12周齡雄性C57BL

21、/6小鼠，分為兩組，手術(shù)組(n=10)，假手術(shù)組(n=10)。手術(shù)組自胸骨上窩結(jié)扎主動(dòng)脈弓部致其縮窄，假手術(shù)組術(shù)式與手術(shù)組相同，但不做主動(dòng)脈弓縮窄。并分別于術(shù)后24小時(shí)后處死動(dòng)物留取標(biāo)本。
　　 (2)壓力負(fù)荷改變與主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中ACE2表達(dá)的關(guān)系
　　 應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR、Westernblot技術(shù)分別測(cè)定主動(dòng)脈弓結(jié)扎上、下游血管段ACE2的mRNA和蛋白表達(dá)水平;免疫組化雙染測(cè)定ACE2在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)。

22、
　　 12.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析，使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.不同作用時(shí)間下，不同水平的牽張力對(duì)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ACE2、ACE、MASmRNA表達(dá)的影響
　　 研究結(jié)果顯示，ACE2與ACE、MAS均為牽張力敏感的RAS基因。與靜態(tài)對(duì)照

23、組比較，10％牽張力作用后1小時(shí)ACE2、MAS、ACEmRNA水平與靜態(tài)對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯改變(P＞0.05），作用3h后ACE2mRNA水平比靜態(tài)對(duì)照組明顯增高，于6h達(dá)峰(3.1fold，P＜0.01)，而且增高趨勢(shì)保持到24h，MASmRNA水平自3h開(kāi)始上升，6h達(dá)到峰值(2.4fold，P＜0.01)，24小時(shí)仍比靜態(tài)對(duì)照組明顯增高，而ACEmRNA水平在1h、3h時(shí)輕度增高但無(wú)顯著性意義，在10％牽張力作用12h、24h時(shí)

24、ACEmRNA水平較靜態(tài)組明顯降低(0.41fold，P＜0.05);與靜態(tài)對(duì)照組比較，15％牽張力作用3h后，ACE2、MASmRNA水平比靜態(tài)對(duì)照組表達(dá)增高(分別為1.8fold，1.65fold，P＜0.01，P＜0.05)，15％牽張力作用12、24小時(shí)后，其ACE2、MASmRNA水平比靜態(tài)對(duì)照組明顯降低(0.37fold，0.44fold，P＜0.05)，而ACEmRNA水平在15％牽張力作用6h顯著增高，12h達(dá)峰(2.3

25、5fold，P＜0.01)，于24h仍較靜態(tài)組明顯增加(2.19fold，P＜0.01);將PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示:ACE2于108bp、ACE于142bp、MAS于94bp處顯示清晰的條帶。為了觀察RAS系統(tǒng)中兩個(gè)主要的酶對(duì)相同牽張力的不同反應(yīng)，我們比較了相同牽張力情況下ACE2及ACE的變化情況，結(jié)果表明:在10％的牽張力作用下1小時(shí)，ACE2比ACE明顯上調(diào)(P＜0.05)，而繼續(xù)牽張3h至24h，與ACE的mRNA水

26、平相比，ACE2始終明顯高表達(dá)(P＜0.01);而15％的牽張力作用1小時(shí)、3小時(shí)，ACE2與ACE的mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著性差異，繼續(xù)牽張至6小時(shí)，ACE的mRNA表達(dá)較ACE2明顯上調(diào)(P＜0.05)，至12、24小時(shí)，ACE的mRNA表達(dá)保持顯著上調(diào)(P＜0.01)。
　　 2.WesternBlot結(jié)果
　　 Westernblot結(jié)果顯示，10％牽張力干預(yù)細(xì)胞1、3小時(shí)，ACE2蛋白表達(dá)未見(jiàn)有明顯改變(P＞0.0

27、5)，干預(yù)HASMCs6小時(shí)后，ACE2蛋白表達(dá)較靜態(tài)對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），10％牽張力干預(yù)24小時(shí)之后，ACE2蛋白表達(dá)水平仍然增高(P＜0.01);而15％牽張力刺激細(xì)胞3小時(shí)后，引起ACE2蛋白表達(dá)水平短暫升高(P＜0.01），而在12、24小時(shí)，ACE2表達(dá)呈明顯下調(diào)趨勢(shì)(P＜0.01)。
　　 3.ACE2活性變化
　　 10％牽張力分別干預(yù)HASMCs1、3、6小時(shí)后，ACE2活性沒(méi)有顯著改變;12

28、小時(shí)后，ACE2活性比靜態(tài)對(duì)照組明顯增加并達(dá)到峰值(P＜0.01)，而且這種增高趨勢(shì)持續(xù)到24h;15％牽張力分別干預(yù)HASMCs1、3、6小時(shí)，對(duì)ACE2的活性均沒(méi)有顯著影響，干預(yù)12、24小時(shí)后，ACE2活性顯著降低(P＜0.01)。
　　 4.牽張力對(duì)Ang-(1-7)及AngⅡ產(chǎn)生量的影響
　　 10％牽張力作用1h、3h、6h后，AngⅡ、Ang-(1-7)水平與靜態(tài)對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯改變(P＞0.05);10

29、％牽張力作用12h、24h后，與靜態(tài)對(duì)照組相比，AngⅡ水平明顯降低(P＜0.01)，而Ang-(1-7)水平明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。15％牽張力作用1h、3h后，AngⅡ、Ang-(1-7)水平比靜態(tài)對(duì)照組無(wú)明顯變化，15％牽張力作用6h后，其AngⅡ水平比靜態(tài)對(duì)照組顯著增加(P＜0.05)，而Ang-(1-7)水平較靜態(tài)組無(wú)顯著變化(P＞0.05)。15％牽張力作用12h、24h后，AngⅡ水平比靜態(tài)對(duì)照組顯著升高(

30、P＜0.05，P＜0.01)，而Ang-(1-7)水平明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 5.ACE2免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果
　　 給予HASMCs10％周期性牽張力干預(yù)12小時(shí)，細(xì)胞免疫熒光進(jìn)一步顯示:與靜態(tài)培養(yǎng)相比，生理牽張力顯著上調(diào)ACE2蛋白表達(dá)水平。
　　 6.ACE2在牽張力調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用
　　 (1)采用Brdu摻入法結(jié)果提示10％牽張力能夠抑制HASMCs的增殖。

31、
　　 (2)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證明10％牽張力能夠抑制HASMCs的遷移。
　　 (3)轉(zhuǎn)染ACE2siRNA48小時(shí)后ACE2表達(dá)水平顯著下調(diào)，與單純牽張力組比較，下調(diào)ACE2的表達(dá)能夠部分抵消10％牽張力抑制平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的作用。
　　 7.組織免疫熒光檢測(cè)結(jié)果
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共20只，除1只死于手術(shù)前麻醉外，其余全部成活并順利完成實(shí)驗(yàn)。
　　 組織免疫熒光結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比，ACE2

32、在結(jié)扎近心端的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)明顯減低;而在結(jié)扎遠(yuǎn)心端的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)沒(méi)有明顯改變;Westernblot及實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果亦顯示:主動(dòng)脈弓結(jié)扎近心端ACE2蛋白及mRNA表達(dá)水平下調(diào)，而主動(dòng)脈弓結(jié)扎遠(yuǎn)心端血管段ACE2表達(dá)沒(méi)有變化。
　　 結(jié)論：
　　 1.生理性牽張力能夠持續(xù)上調(diào)平滑肌細(xì)胞中ACE2的表達(dá)，而病理性牽張力早期雖上調(diào)ACE2表達(dá)，但隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。
　　 2.A

33、CE2參與生理牽張力對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用;
　　 3.在主動(dòng)脈弓結(jié)扎的小鼠中，與假手術(shù)組相比，異常的牽張力增加可以降低血管平滑肌細(xì)胞ACE2的表達(dá)。
　　 第二部分：牽張力調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞ACE2的分子機(jī)制研究
　　 由于血管一直暴露于血流動(dòng)力學(xué)的作用下，異常的血液流體力學(xué)可作用于血管壁細(xì)胞導(dǎo)致動(dòng)脈血管病變的發(fā)生、發(fā)展。我國(guó)高血壓患者已高達(dá)2億，高血壓病往往伴有周期性機(jī)械牽張力的增加，從而引起血管壁

34、平滑肌細(xì)胞的形態(tài)和功能改變，進(jìn)一步造成血管重構(gòu)，導(dǎo)致高血壓終末器官損害如心、腦血管疾病及高血壓腎病的發(fā)生、發(fā)展;位于血管壁中層的平滑肌細(xì)胞的形態(tài)和功能異常在動(dòng)脈血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。腎素-血管緊張素(RAS)系統(tǒng)與心血管疾病密切相關(guān)，近年來(lái)，RAS系統(tǒng)新成員血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)對(duì)血管的保護(hù)作用受到了重視，ACE2在高血壓大鼠血管壁中、糖尿病心肌病和腎病以及心肌梗死動(dòng)物模型中可以改善心臟及血管重構(gòu)。我們實(shí)驗(yàn)室最

35、近的研究證明在動(dòng)脈粥樣硬化模型中ACE2過(guò)表達(dá)可延緩斑塊的發(fā)生發(fā)展，具有減少斑塊易損指數(shù)，穩(wěn)定斑塊的作用。機(jī)械牽張力可影響平滑肌細(xì)胞AngⅡ的分泌，但是對(duì)于ACE2的作用尚不明了。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)與靜態(tài)對(duì)照組比較，生理牽張力(10％elongation，1Hz)顯著上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞ACE2的表達(dá)及活性，而過(guò)度增強(qiáng)的病理牽張力(15％elongation，1Hz)卻下調(diào)血管平滑肌細(xì)胞ACE2的表達(dá)與活性，此外，我們的前期研究還發(fā)現(xiàn)AC

36、E2參與牽張力對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖、遷移功能的調(diào)節(jié)作用。這些研究提示:機(jī)械牽張力可能通過(guò)ACE2影響平滑肌細(xì)胞的功能和血管壁的重構(gòu)，但是牽張力調(diào)控ACE2的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步的深入研究。近年來(lái)關(guān)于牽張力調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞功能的分子機(jī)制研究取得了一定進(jìn)展。盡管迄今尚未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面存在特異的生物力學(xué)信號(hào)感受器，但位于胞膜表面的整合素、酪氨酸受體激酶、離子通道、小凹蛋白等結(jié)構(gòu)均可以將胞外的力學(xué)刺激傳導(dǎo)到胞內(nèi)，激活PKC、MAPK、PI3K/Akt等多

37、種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及活化AP-1、NF-κB、Egr-1、Sp-1等多種轉(zhuǎn)錄因子，最終通過(guò)改變細(xì)胞增殖、凋亡、表型分化等相關(guān)基因的表達(dá)而影響細(xì)胞功能。
　　 近年來(lái)，有關(guān)學(xué)者利用病毒載體或人工重組合成ACE2，在動(dòng)物水平充分證明了ACE2的心血管保護(hù)作用，在體外水平上驗(yàn)證了其對(duì)各種細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。然而，各種病理生理刺激調(diào)控ACE2表達(dá)的分子機(jī)制目前還知之甚少。盡管有研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞中AngⅡ可以通過(guò)激活ERK1

38、/2信號(hào)通路抑制ACE2表達(dá)，但另一項(xiàng)研究卻發(fā)現(xiàn)在肝星狀細(xì)胞中，AngⅡ上調(diào)ACE2的表達(dá);此外，研究表明過(guò)表達(dá)ACE2同樣可以抑制ACE、AT1R的表達(dá)，及AngⅡ的分泌。以上充分說(shuō)明了ACE2表達(dá)調(diào)控與RAS系統(tǒng)各組分之間關(guān)系的復(fù)雜性。既往有研究表明，高糖可以下調(diào)PKC-βⅡ的表達(dá)，后者可以下調(diào)SMCs中ACE2的表達(dá)及Ang-(1-7)的生成;牽張力可以激活MAPK、Akt、PKC信號(hào)通路，并活化AP-1、NF-κB、Sp-1等轉(zhuǎn)

39、錄因子，而ACE2啟動(dòng)子序列中含有多個(gè)AP-1、Sp-1結(jié)合位點(diǎn)。但是牽張力如何影響ACE2表達(dá)的機(jī)制目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。目前在心血管領(lǐng)域，關(guān)于ACE2的研究大多數(shù)集中在對(duì)其下游功能的研究上，而對(duì)其自身表達(dá)調(diào)控知之甚少，牽張力通過(guò)什么信號(hào)通路調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞上ACE2的表達(dá)？AP-1、NF-κB是否參與牽張力調(diào)節(jié)ACE2表達(dá)？這些問(wèn)題都有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。
　　 本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，深入研究生理性周期牽張力(10％el

40、ongation，1Hz)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)的分子機(jī)制，該研究將對(duì)動(dòng)脈血管疾病的發(fā)生機(jī)制提供新的思路，對(duì)進(jìn)一步理解RAS系統(tǒng)在維持血管功能與血管重塑中的作用與機(jī)制，尋找干預(yù)血管重構(gòu)相關(guān)疾病的新靶點(diǎn)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 研究目的：
　　 1.明確生理牽張力對(duì)ACE2啟動(dòng)子活性及mRNA穩(wěn)定性的影響;
　　 2.確定生理牽張力調(diào)節(jié)人平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子;
　　 3.明確生理

41、牽張力調(diào)節(jié)人平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)的主要信號(hào)通路。
　　 研究方法：
　　 1.人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)及牽張力干預(yù)
　　 前期實(shí)驗(yàn)購(gòu)得人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株(HASMCScienCell)，采用ScienCell平滑肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基(SMCGS、2％FBS、1％penicillin-streptomycin)培養(yǎng)細(xì)胞，4-7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。接種平滑肌細(xì)胞(HASMCs)至鋪有Ⅰ型膠原的Flexcell六孔板中（10

42、5個(gè)細(xì)胞/孔），待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90％融合時(shí)，無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)，更換新的完全培養(yǎng)基，使用Flexcell-5000Tension細(xì)胞拉力儀給予細(xì)胞牽張力(10％elongation，1Hz)刺激。
　　 2.細(xì)胞牽張力干預(yù)分組
　　 2.1、牽張力對(duì)ACE2mRNA穩(wěn)定性的影響
　　 (1)靜態(tài)對(duì)照組:靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞，不給予任何通路抑制劑干預(yù)。
　　 (2)牽張力干預(yù)組:給予HASMCs牽張力

43、(10％elongation，1Hz)刺激12小時(shí)。
　　 牽張力刺激12小時(shí)后，與靜止對(duì)照組一起，添加放線菌素D(5ug/ml)至細(xì)胞培養(yǎng)上清中，以抑制新的轉(zhuǎn)錄，分別用放線菌素D干預(yù)0、6、12小時(shí)，利用TRIzol提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)，結(jié)果以不同時(shí)間點(diǎn)的mRNA水平與加入放線菌素D0小時(shí)的mRNA的比值來(lái)表示。觀察與靜態(tài)對(duì)照組相比較，生理牽張力是否增加平滑肌細(xì)胞ACE2

44、mRNA的穩(wěn)定性。
　　 2.2、牽張力對(duì)ACE2啟動(dòng)子活性的影響
　　 設(shè)計(jì)ACE2啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增引物，PCR擴(kuò)增、電泳后切膠，并行PCR產(chǎn)物回收，連接T載體和細(xì)胞轉(zhuǎn)化，構(gòu)建ACE2啟動(dòng)子載體(pGL3-ACE2-promoter)，利用Invitrogenlip2000將啟動(dòng)子載體與PRL-TK載體共轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞24小時(shí)后，給予牽張力(10％elongation，1Hz)刺激3小時(shí)或靜止培養(yǎng)3小時(shí)，利用Prome

45、ga雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)牽張力(10％elongation，1Hz)對(duì)ACE2啟動(dòng)子活性的影響。
　　 2.3、確定介導(dǎo)生理牽張力(10％elongation，1Hz)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子
　　 (1)靜態(tài)對(duì)照組:靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞，不給予任何通路抑制劑干預(yù)。
　　 (2)牽張力對(duì)照組:分別給予HASMCs牽張力干預(yù)15min、30min、1h、2h。
　　 (3)SN50組

46、:先給予HASMCsSN50(18μM)預(yù)處理1小時(shí)，再給予牽張力刺激6小時(shí)。
　　 (4)Curcumin組:先給予HASMCsCurcumin(10uM)預(yù)處理1小時(shí)，再給予牽張力刺激6小時(shí)。
　　 (5)WP631組:先給予HASMCsWP631(100nM)預(yù)處理1小時(shí)，再給予牽張力刺激6小時(shí)。
　　 Westernblot檢測(cè)p65、p-p65、c-fos、p-c-fos、c-jun、p-c-jun、S

47、p-1、p-Sp-1、ACE2蛋白表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ACE2mRNA變化;EMSA檢測(cè)NF-κ3、AP-1的DNA結(jié)合能力;
　　 2.4、MAPK信號(hào)通路在牽張力(10％elongation，1Hz)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)中的作用
　　 (1)靜態(tài)對(duì)照組:靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞，不給予任何通路抑制劑干預(yù)。
　　 (2)牽張力對(duì)照組:分別給予HASMCs牽張力刺激15min、30min、1h、2h。

48、r>　　 (3)PD98059組:先給予HASMCsERK1/2抑制劑PD98059(30uM)預(yù)處理1小時(shí)，再給予牽張力刺激6h。
　　 (4)SP600125組:先給予HASMCsJNK1/2抑制劑SP600125（20μM）預(yù)處理1小時(shí)，再給予牽張力刺激6h。
　　 (5)SB203580組:先給予HASMCsp38抑制劑SB203580(10μM)預(yù)處理1小時(shí)，再給予牽張力刺激6h。
　　 Wester

49、nblot檢測(cè)ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK1/2、p-JNK1/2、ACE2的蛋白表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ACE2mRNA變化;并檢測(cè)下游轉(zhuǎn)錄因子的活性。
　　 2.5、PKC-Ⅱ信號(hào)通路在牽張力(10％elongation，1Hz)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)中的作用
　　 (1)靜態(tài)對(duì)照組:靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞，不給予任何通路抑制劑干預(yù)。
　　 (2)牽張力對(duì)照組:分別給予HAS

50、MCs牽張力刺激15min、30min、1h、2h。
　　 (3)CG53353組:先給予HASMCsPKC-βⅡ抑制劑CG53353（100nM）預(yù)處理1小時(shí)，再給予牽張力刺激6h。
　　 觀察PKC-βⅡ的磷酸化水平;ACE2mRNA及蛋白表達(dá)水平;下游轉(zhuǎn)錄因子的活性。
　　 2.6、Akt信號(hào)通路在牽張力(10％elongation，1Hz)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)中的作用
　　 (1)靜態(tài)對(duì)照組

51、:靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞，不給予任何通路抑制劑干預(yù)。
　　 (2)牽張力對(duì)照組:分別給予HASMCs牽張力刺激15min、30min、1h、2h。
　　 (3)LY294002組:先給予HASMCsAkt抑制劑LY294002(50μM)預(yù)處理1小時(shí)，再給予牽張力刺激6h。
　　 觀察Akt、p-Akt的表達(dá);ACE2mRNA、蛋白表達(dá)水平。
　　 3.實(shí)驗(yàn)方法
　　 應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)ACE2

52、mRNA的表達(dá)量;用Westernblot技術(shù)檢測(cè)信號(hào)蛋白表達(dá)和磷酸化水平;EMSA檢測(cè)AP-1、NF-κB與DNA的結(jié)合活性。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用SPSS16.0軟件中的單因素方差分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.牽張力對(duì)ACE2mRNA穩(wěn)定性無(wú)明顯影響
　　 給予HASMCs10％周期

53、性牽張力干預(yù)12小時(shí)后，與放線菌素D(5μg/ml)孵育以阻斷新的轉(zhuǎn)錄合成，靜態(tài)培養(yǎng)的細(xì)胞給予同樣劑量的放線菌素D處理作為對(duì)照，分別在放線菌素D干預(yù)0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)提取RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)，結(jié)果以不同時(shí)間點(diǎn)的mRNA水平與加入放線菌素D0小時(shí)的mRNA的比值來(lái)表示。結(jié)果表明:與靜態(tài)對(duì)照組相比較，牽張力干預(yù)組平滑肌細(xì)胞mRNA的降解速度沒(méi)有明顯的變化(P＞0.05)。
　　 2.生理牽張力(10

54、％elongation，1Hz)明顯增強(qiáng)ACE2啟動(dòng)子活性
　　 成功構(gòu)建人ACE2啟動(dòng)子載體(pGL3-ACE2-promoter)，ACE2啟動(dòng)子長(zhǎng)度1908bp;利用脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染pGL3-ACE2-promoter與pGL3-basicvector，然后給予10％周期性牽張力刺激HASMCs3小時(shí)，收集細(xì)胞，利用Promega雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定牽張力干預(yù)組及靜態(tài)對(duì)照組細(xì)胞ACE2啟動(dòng)子的活性。結(jié)果顯

55、示，10％牽張力顯著增強(qiáng)ACE2啟動(dòng)子的活性(2.7fold，P＜0.05)。
　　 3.AP-1調(diào)節(jié)牽張力(10％elongation，1Hz)介導(dǎo)的HASMCsACE2mRNA、蛋白表達(dá)變化
　　 分別給予平滑肌細(xì)胞10％周期性牽張力刺激15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)，收集細(xì)胞提取胞漿蛋白，Westernblot檢測(cè)AP-1的兩個(gè)主要組分c-jun、c-fos，以及磷酸化形式的c-jun，c-fos的表達(dá)情況，結(jié)

56、果顯示:10％牽張力上調(diào)c-jun以及磷酸化c-jun的表達(dá)，但對(duì)c-fos以及磷酸化c-fos的表達(dá)沒(méi)有顯著影響;牽張力刺激前1小時(shí)，Curcumin(10uM)孵育細(xì)胞，繼之10％牽張力刺激細(xì)胞6小時(shí)，發(fā)現(xiàn)ACE2mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)較單純牽張力組均明顯降低（P＜0.05）;10％牽張力刺激平滑肌細(xì)胞0小時(shí)、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)，收集細(xì)胞提取核蛋白，利用EMSA技術(shù)檢測(cè)牽張力對(duì)AP-1DNA結(jié)合能力的影響，結(jié)果顯示10％牽張力增

57、強(qiáng)AP-1的DNA結(jié)合能力，利用AP-1的冷競(jìng)爭(zhēng)探針能抑制牽張力誘導(dǎo)的AP-1的DNA結(jié)合能力;免疫熒光染色顯示10％牽張力促進(jìn)c-jun的核轉(zhuǎn)位，而不影響c-fos的核移位。
　　 4.NF-κB參與牽張力(10％elongation，1Hz)對(duì)HASMCsACE2mRNA、蛋白表達(dá)的調(diào)控
　　 給予平滑肌細(xì)胞10％周期性牽張力刺激15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)，收集細(xì)胞提取胞漿蛋白，Westernblot檢測(cè)p6

58、5，磷酸化p65的表達(dá)，結(jié)果顯示牽張力干預(yù)細(xì)胞1小時(shí)，磷酸化p65的表達(dá)升高達(dá)到峰值并維持到2小時(shí);給予平滑肌細(xì)胞SN50預(yù)孵育1小時(shí)，繼之以10％牽張力刺激6小時(shí)，Westernblot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:SN50組較單純的牽張力干預(yù)組ACE2的蛋白及mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步升高(P＜0.05）;10％牽張力刺激平滑肌細(xì)胞0小時(shí)、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)，提取細(xì)胞核蛋白，EMSA測(cè)定10％牽張力對(duì)NF-κBDNA結(jié)合能力的影響，

59、結(jié)果顯示:與靜態(tài)對(duì)照組相比，牽張力干預(yù)組細(xì)胞NF-κB的DNA結(jié)合能力明顯增強(qiáng)，NF-κB抑制劑SN50和NF-κB冷競(jìng)爭(zhēng)探針能有效抑制NF-κB的DNA結(jié)合能力。
　　 5.Sp-1未參與調(diào)節(jié)牽張力(10％elongation，1Hz)介導(dǎo)的HASMCs對(duì)ACE2mRNA、蛋白表達(dá)變化
　　 分別給予平滑肌細(xì)胞10％周期性牽張力刺激15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)，收集細(xì)胞提取胞漿蛋白，Westernblot檢測(cè)Sp

60、-1以及磷酸化Sp-1的表達(dá)，結(jié)果顯示牽張力刺激HASMCs15分鐘，磷酸化Sp-1的表達(dá)明顯升高，于1小時(shí)達(dá)峰，總Sp-1沒(méi)有顯著變化;利用Sp-1藥理學(xué)抑制劑WP631（100nM）預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)，然后再給予10％牽張力刺激6小時(shí)，收集細(xì)胞提取RNA和蛋白，Westernblot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:單純牽張力明顯上調(diào)HASMCsACE2的蛋白和mRNA表達(dá)水平，WP631對(duì)牽張力介導(dǎo)的ACE2的蛋白和mRNA表達(dá)改變沒(méi)有

61、顯著影響(P＞0.05)。
　　 6.PKC-βⅡ?qū)繌埩?10％elongation，1Hz)介導(dǎo)的NF-κB/ACE2、AP-1/ACE2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　 10％周期性牽張力分別刺激人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)，Westernblot檢測(cè)PKCβⅡ以及磷酸化PKCβⅡ的表達(dá)，結(jié)果顯示10％牽張力干預(yù)HASMCs15min后，磷酸化PKCβⅡ表達(dá)明顯升高，升高趨勢(shì)持續(xù)到2h;給予HASM

62、CsPKCβⅡ藥理學(xué)抑制劑CG53353(100nM)預(yù)處理1小時(shí)，繼之給予10％牽張力刺激6小時(shí)，收集細(xì)胞提取RNA和蛋白，Westernblot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:牽張力明顯上調(diào)HASMCsACE2的蛋白和mRNA表達(dá)水平(P＜0.01)，CG53353部分抵消牽張力上調(diào)ACE2蛋白和mRNA表達(dá)的作用(P＜0.01);CG53353（100nM）預(yù)處理1小時(shí)，繼之給予10％牽張力刺激3小時(shí)，提取核蛋白，EMSA測(cè)定AP-

63、1及NF-κB的DNA結(jié)合能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制PKCβⅡ的活性，有效抑制牽張力對(duì)AP-1、NF-κB活性的激活。
　　 7.Akt信號(hào)通路對(duì)牽張力(10％elongation，1Hz)介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)的影響
　　 10％周期性牽張力分別刺激人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)，Westernblot檢測(cè)Akt以及磷酸化Akt的表達(dá)，結(jié)果顯示，牽張力干預(yù)HASMCs30min后，磷酸化Akt

64、表達(dá)顯著升高;給予HASMCsAkt信號(hào)通路抑制劑LY294002(50μM)預(yù)孵育1小時(shí)，繼之以10％牽張力刺激6小時(shí)，收集細(xì)胞提取RNA和蛋白，Westernbiot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:10％牽張力上調(diào)平滑肌細(xì)胞ACE2蛋白及mRNA表達(dá)，LY294002對(duì)牽張力的這種上調(diào)作用沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）。
　　 8.ERK1/2信號(hào)通路對(duì)生理牽張力(10％elongation，1Hz)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)的

65、影響
　　 10％周期性牽張力分別刺激HASMCs15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)，Westernblot檢測(cè)ERK1/2以及磷酸化ERK1/2的表達(dá)，結(jié)果顯示，牽張力刺激細(xì)胞15分鐘后，磷酸化ERK1/2表達(dá)明顯增加，刺激2小時(shí)后，磷酸化ERK1/2水平恢復(fù)至靜態(tài)對(duì)照組水平;預(yù)先給予HASMCsERK1/2信號(hào)通路抑制劑PD98059(30uM)處理1小時(shí)，然后給予10％周期性牽張力刺激6小時(shí)，Westernblot及實(shí)時(shí)熒

66、光定量PCR觀察ACE2蛋白及mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，PD98059干預(yù)組ACE2表達(dá)水平與單純牽張力組沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，均高于對(duì)照組水平。
　　 9.p38MAPK對(duì)牽張力(10％elongation，1Hz)介導(dǎo)的NF-κB/ACE2、AP-1/ACE2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　 采用10％周期性牽張力分別刺激HASMCs15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)，Westernblot檢測(cè)p38以及磷酸化p3

67、8的表達(dá)，結(jié)果顯示磷酸化p38自牽張力刺激15分鐘開(kāi)始升高，30分鐘達(dá)到高峰，1小時(shí)恢復(fù)靜態(tài)對(duì)照組水平;給予HASMCsp38藥理學(xué)抑制劑SB203580(10μM)處理1小時(shí)，然后給予10％周期性牽張力刺激6小時(shí)，Westernblot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR觀察ACE2蛋白及mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，10％周期性牽張力顯著上調(diào)ACE2表達(dá)，SB203580預(yù)處理對(duì)牽張力誘導(dǎo)的ACE2表達(dá)上調(diào)沒(méi)有抑制作用（P＞0.05）。
　　

68、 10.JNK1/2對(duì)牽張力(10％elongation，1Hz)介導(dǎo)的NF-κB/ACE2、AP-1/ACE2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　 給予HASMCs10％周期性牽張力分別刺激HASMCs15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)，Westernblot檢測(cè)JNK1/2以及磷酸化JNK1/2的表達(dá)，結(jié)果顯示磷酸化JNK1/2自牽張力刺激15分鐘開(kāi)始升高，30分鐘達(dá)到高峰，1小時(shí)恢復(fù)靜態(tài)對(duì)照組水平;利用JNK1/2藥理學(xué)抑制劑SP60

69、0125(20μM)預(yù)處理HASMCs1小時(shí)，然后再給予10％周期性牽張力刺激6小時(shí)，Westernblot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR觀察ACE2蛋白及mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，10％周期性牽張力顯著上調(diào)ACE2表達(dá)(P＜0.01)，而SP600125預(yù)處理對(duì)10％牽張力誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞ACE2表達(dá)有明顯的抑制作用(P＜0.01);SP600125（20μM）預(yù)處理1小時(shí)，繼之給予10％牽張力刺激3小時(shí)，提取核蛋白，EMSA測(cè)定AP-1、NF

70、-κB的DNA結(jié)合活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制JNK1/2的活性，能有效消減牽張力對(duì)AP-1、NF-κβ活性的激活。
　　 結(jié)論：
　　 1.牽張力通過(guò)增強(qiáng)AP-1與DNA結(jié)合的活性提高血管平滑肌細(xì)胞ACE2的表達(dá)。通過(guò)增強(qiáng)NF-κB與DNA結(jié)合的活性抑制血管平滑肌細(xì)胞ACE2的表達(dá)。
　　 2.牽張力可以通過(guò)JNK1/2、PKC-βⅡ活化調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞ACE2的表達(dá)。
　　 總之，牽張力通過(guò)JNK1/2、P