中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)生殖相關基因的克隆及其表達模式研究.pdf

1、生殖細胞的發(fā)生是發(fā)育生物學研究的主要內(nèi)容之一，同時也是一個復雜的發(fā)育調(diào)控并涉及時空的多基因活動過程。其中原始生殖細胞起源、遷徙、分化等方面的研究，是備受關注的生物學研究方向。與其他模式生物相比，十足目動物關于生殖發(fā)育的分子機制方面的研究相對薄弱。因此，鑒定和發(fā)現(xiàn)十足目生殖相關的基因并探索其功能，具有重要意義和潛在的應用價值。本文以中華絨螯蟹為研究對象，通過現(xiàn)有研究和相關文獻的查閱，對與中華絨螯蟹生殖發(fā)育有著密切聯(lián)系的vasa、piwi、

2、nanos、PL10基因進行研究。研究主要分為四個部分：
　　1、中華絨螯蟹vasa基因的表達分析及表達模式研究
　　vasa基因是生殖質(zhì)的主要組成成分之一，且在生殖腺中特異性表達，?？勺鳛槭聚櫳诚傩纬傻姆肿訕擞?。本文采用實時熒光定量PCR技術對vasa基因在中華絨螯蟹胚胎及幼體發(fā)育階段的表達情況進行了研究，研究發(fā)現(xiàn)，vasa mRNA在胚胎發(fā)育時期表達量相對幼體發(fā)育階段表達量要高，推測vasa mRNA可能主要作用于胚胎

3、發(fā)育階段。對精巢和卵巢的原位雜交結果表明，vasa mRNA在精母細胞中分布于染色質(zhì)中，在精子細胞中主要分布于核杯，在卵母細胞中定位于細胞質(zhì)。整胚原位雜交發(fā)現(xiàn)，胚胎和幼體發(fā)育時期vasa mRNA表達集中分布，可根據(jù)vasa mRNA的分布初步推斷中華絨螯蟹的性腺生成軌跡。
　　2、中華絨螯蟹piwi基因克隆及表達研究
　　Piwi基因在果蠅中有維持生殖干細胞和調(diào)節(jié)細胞分裂的功能，甲殼類中對此基因的研究非常少。本文采用SMA

4、RTTM RACE技術，克隆了piwi基因全長序列。piwi基因的cDNA全長3253bp（GenBank注冊號：KR061909），5’UTR26bp，3’UTR179bp，開放閱讀框ORF2868bp，編碼955個氨基酸。多序列比對和同源性分析表明中華絨螯蟹的piwi基因和三疣梭子蟹的piwi基因同源性為70％?？缒^(qū)分析表明PIWI蛋白為親水性蛋白結構。通過實時熒光定量PCR分析表明，piwi mRNA在血液、肌肉、心臟、胸神經(jīng)節(jié)

5、、鰓、肝胰腺、腸、卵巢、精巢中均有表達。但是在性腺中的表達要明顯高于其他各組織，隨著精巢的發(fā)育變化，piwi mRNA的表達量逐漸減少，在精母細胞時期表達量最高；同樣在卵巢中piwi mRNA也隨著卵巢的發(fā)育而發(fā)生波動，在卵母細胞期表達量最高。在胚胎和幼體發(fā)育階段，大眼幼體期表達量最高。對精巢和卵巢的原位雜交結果表明，piwi mRNA在精母細胞中分布于染色質(zhì)中，在精子細胞中主要分布于核杯中，在卵母細胞中定位于細胞質(zhì)。整胚原位雜交發(fā)現(xiàn)，

6、以piwi mRNA陽性信號指示的生殖腺原基在心跳期已比較明顯，溞狀幼體I期時分布于頭胸甲與腹部交接處，隨著發(fā)育逐漸集中于頭胸甲背部，至溞狀幼體II期時已向頭胸甲遷移，溞狀幼體III期時更加集中，完全位于頭胸甲的背面的一個區(qū)域。
　　3、中華絨螯蟹nanos基因克隆及表達研究
　　nanos mRNA和vasa mRNA是性腺的最初成分P顆粒中的2個最重要的組成成分。本文采用SMARTTM RACE技術，克隆了中華絨螯蟹na

7、nos基因，nanos基因cDNA序列全長2886bp（GenBank注冊號：KR061910），5’UTR59bp，3’UTR1543bp，開放閱讀框ORF1284bp，編碼427個氨基酸?？缒^(qū)分析表明NANOS蛋白為親水性蛋白結構。實時熒光定量PCR分析表明，nanos mRNA在血液、肌肉、心臟、胸神經(jīng)節(jié)、鰓、肝胰腺、腸、卵巢、精巢中均有表達，其中在血液中表達量最低，在性腺中表達量最高，且精巢中表達量高于卵巢。卵巢中nanos基

8、因在卵巢發(fā)育的大生長期（對數(shù)生長期）早期達到峰值，隨著卵巢發(fā)育趨向成熟，有下降趨于平緩的趨勢；在精巢發(fā)育過程中，在7月份的精母細胞期表達量最高，后逐漸降低，至精子發(fā)生早期又急劇升高，形成精子后迅速下降。在胚胎和幼體發(fā)育時期，在大眼幼體期的表達量最高，與其他各期差異極為顯著。對精巢和卵巢的原位雜交結果表明，nanos mRNA在精母細胞中分布于染色質(zhì)中，在精子細胞中主要分布于核杯中，在卵母細胞中定位于細胞質(zhì)。整胚原位雜交發(fā)現(xiàn)，以nanos

9、 mRNA陽性信號指示的生殖腺原基在出膜前期比較明顯，溞狀幼體I期時nanos陽性信號分布于頭胸甲與腹部交接處，隨著發(fā)育逐漸集中于頭胸甲背部，至溞狀幼體II期時已完全分布于頭胸甲，溞狀幼體III期時更加集中，完全位于頭胸甲的背面的一個區(qū)域。
　　4、中華絨螯蟹PL10基因克隆及表達研究
　　PL10基因是vasa的祖先基因。本實驗克隆得到的中華絨螯蟹PL10基因片段序列長1671bp（Genbank注冊號：KR061911）

10、，編碼566個氨基酸。多序列比對和同源性分析表明中華絨螯蟹的PL10基因和秀麗白蝦、日本沼蝦、中國明對蝦同源性分別為85%、84%、84%。系統(tǒng)進化分析證明了PL10基因在進化上高度保守。實時熒光定量PCR分析表明，PL10 mRNA在各組織中均有表達，但表達量差異較大，血液、神經(jīng)節(jié)、鰓組織中低量表達，肝胰腺、精巢、卵巢中高量表達。對中華絨螯蟹各發(fā)育階段性腺中PL10 mRNA的實時熒光定量PCR實驗表明，在12月份的精子形成期達到高峰

11、，說明PL10基因參與了精子的發(fā)生；在卵巢中PL10 mRNA的表達在對數(shù)增長前期有小幅上升，對數(shù)生長期后則呈下降趨勢。實時熒光定量PCR實驗表明，PL10基因在胚胎中的表達量高于幼體階段。
　　研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育各期及溞狀幼體階段，vasa和nanos的表達模式相似，說明在此過程中兩者功能相近；PL10基因在胚胎發(fā)育的早期階段的表達量要高于vasa和nanos，說明PL10的功能與vasa和nanos不盡一致。通過以上的研究和