棉鈴蟲及其天敵大草蛉和中華通草蛉嗅覺(jué)相關(guān)基因的克隆與功能研究.pdf

1、精密的嗅覺(jué)系統(tǒng)是昆蟲生存和繁殖的重要保障，通過(guò)嗅覺(jué)昆蟲可以精準(zhǔn)地感受環(huán)境中其它動(dòng)植物釋放的各種化學(xué)氣味，做出相應(yīng)的行為和生理反應(yīng)，如覓食、交配、躲避天敵等。昆蟲的嗅覺(jué)涉及多種蛋白，主要有氣味結(jié)合蛋白(odorant-bindingprotein，OBP)、氣味受體(odorant receptor，OR)、感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuronmembrane protein，SNMP)、離子型受體(ionotropic rec

2、eptor，IR)和氣味降解酶(odorant degrading enzyme，ODE)，并主要由以下幾個(gè)步驟組成:1）外界脂溶性氣味分子穿過(guò)嗅覺(jué)感器表面的微孔進(jìn)入觸角淋巴液并與OBP結(jié)合，形成氣味分子/OBP復(fù)合物;2）復(fù)合物穿過(guò)水溶性的觸角淋巴液到達(dá)嗅覺(jué)神經(jīng)元的樹突表面，氣味分子從復(fù)合物脫離激活樹突膜上的OR;3）OR的激活改變神經(jīng)元細(xì)胞膜的通透性，產(chǎn)生動(dòng)作電位，信號(hào)被進(jìn)一步傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng);4）在完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后，氣味分子被OD

3、E降解，從而恢復(fù)嗅覺(jué)神經(jīng)元的敏感性。另外，化學(xué)感受蛋白(chemosensory protein，CSP)被認(rèn)為具有和OBP相似的功能，在溶解和轉(zhuǎn)運(yùn)脂溶性氣味分子中起作用。近年來(lái)，有關(guān)嗅覺(jué)基因及其功能的研究成為熱點(diǎn)，但針對(duì)雙翅目、鱗翅目及鞘翅目等昆蟲的研究多，對(duì)其它目昆蟲的研究很少;針對(duì)害蟲類群的研究多，對(duì)天敵昆蟲的研究很少。
　　脈翅目中大部分種類是天敵昆蟲，其中大草蛉（Chrysopa pallens Rambur）和中華通草

4、蛉(Chrysoperla sinica Tjeder)可以捕食多種農(nóng)業(yè)害蟲，如:蚜蟲、蚧殼蟲、薊馬及鱗翅目害蟲的卵和低齡幼蟲等，并且適應(yīng)多種類型的農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)，是生物防治的重要種類，但有關(guān)脈翅目昆蟲嗅覺(jué)機(jī)制的研究尚屬空白。棉鈴蟲(HelicoverpaarmigeraHubner)是多食性重要害蟲，主要危害棉花、玉米及多種蔬菜。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉雖然有效降低了棉鈴蟲的危害，但害蟲對(duì)Bt毒素的抗性問(wèn)題逐漸顯現(xiàn)，仍需要開發(fā)有效的替代防治技術(shù)

5、。研究“植物-害蟲-天敵”間的氣味聯(lián)系及其機(jī)制，不僅能為開發(fā)高效的害蟲和天敵引誘劑或驅(qū)避劑應(yīng)用于害蟲的“Push-Pull”防治提供基礎(chǔ)，同時(shí)也可深入探討植物與害蟲及害蟲與天敵間的識(shí)別機(jī)制。本文以棉花-棉鈴蟲-大草蛉和中華通草蛉為系統(tǒng)，重點(diǎn)就棉鈴蟲及其兩種草蛉的嗅覺(jué)相關(guān)基因進(jìn)行分子鑒定和功能分析，主要結(jié)果如下:
　　1.大草蛉嗅覺(jué)相關(guān)基因的鑒定、組織表達(dá)譜及數(shù)字基因表達(dá)譜分析
　　為了高效獲得大草蛉嗅覺(jué)相關(guān)基因，對(duì)大草蛉進(jìn)行

6、了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共鑒定出16個(gè)CpalOBP、17個(gè)CpalCSP和39個(gè)CpalOR基因。進(jìn)一步對(duì)上述CpalOBP、CpalCSP和CpalOR基因進(jìn)行組織表達(dá)譜研究表明，大部分CpalOBP和全部CpalOR基因在觸角中高表達(dá)或特異表達(dá)，而CpalCSP具有更為寬泛的表達(dá)譜。另外，通過(guò)構(gòu)建并分析雌雄蟲10個(gè)不同組織的數(shù)字基因表達(dá)譜文庫(kù)發(fā)現(xiàn)，大部分嗅覺(jué)相關(guān)基因在雌雄蟲觸角中上調(diào);在雌雄蟲間，胸部和腹部基因的表達(dá)差異最大，以雌蟲胸部和腹

7、部上調(diào)的基因數(shù)目最多，并且大多為代謝相關(guān)基因。研究結(jié)果為探索大草蛉的化學(xué)感受機(jī)制提供了重要基礎(chǔ)。
　　2.中華通草蛉嗅覺(jué)相關(guān)基因的鑒定和組織表達(dá)譜分析
　　中華通草蛉是棉鈴蟲的又一種重要天敵，本研究對(duì)其雌雄蟲觸角分別進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共鑒定得到12個(gè)CsinOBP基因、19個(gè)CsinCSP基因和37個(gè)CsinOR基因。進(jìn)一步的組織表達(dá)譜分析顯示，與大草蛉的結(jié)果類似，大部分CsinOBP基因在觸角中高表達(dá)或特異表達(dá)，因此推測(cè)這

8、些基因在嗅覺(jué)中扮演了重要角色。CsinCSP基因表現(xiàn)出寬泛的組織表達(dá)譜，其中CsinCSP4、6、14和16為觸角高表達(dá)，因此可能參與中華通草蛉的化學(xué)感受過(guò)程;其它CsinCSP則可能具有（或同時(shí)具有）嗅覺(jué)以外的作用。CsinOR基因均表現(xiàn)為觸角高表達(dá)或特異表達(dá)，與OR在嗅覺(jué)中的重要功能一致;在所有的CsinOR中CsinORco的表達(dá)量最高，與ORco作為所有OR的輔助受體的功能也是一致的。
　　3.大草蛉與中華通草蛉嗅覺(jué)相關(guān)基

9、因的比較分析
　　大草蛉和中華通草蛉的幼蟲食性相同，均取食蚜蟲，但成蟲食性完全不同，大草蛉成蟲主要以蚜蟲等昆蟲為食，中華通草蛉成蟲則主要以花粉、花蜜、蜜露為食。為了探究?jī)煞N草蛉嗅覺(jué)基因與食性的關(guān)系，將CSP、OBP和OR基因的組織表達(dá)譜、系統(tǒng)發(fā)育和mRNA豐度在兩種草蛉間進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明，OBP、CSP和OR基因在大草蛉和中華通草蛉進(jìn)化過(guò)程中共發(fā)生了12次gain和17次loss事件，說(shuō)明嗅覺(jué)基因間的差異與兩種草蛉食性的分

10、化有一定的聯(lián)系;大草蛉CpalOBP和CpalOR基因的總表達(dá)豐度分別為20718和334，小于中華通草蛉33662和444，并且CpalORco的表達(dá)豐度比CsinORco低580倍，暗示兩種草蛉的嗅覺(jué)模式可能存在差異。
　　4.大草蛉氣味結(jié)合蛋白的功能研究
　　采用原核表達(dá)技術(shù)成功表達(dá)并純化了9個(gè)CpalOBP，并通過(guò)熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)對(duì)這9個(gè)CpalOBP與85種氣味物質(zhì)的結(jié)合能力進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，CpalOBP與32

11、種植物氣味、害蟲誘導(dǎo)揮發(fā)物及法尼烯有很強(qiáng)的結(jié)合能力(Ki＜20μM)，推測(cè)其在大草蛉尋找棲息地和產(chǎn)卵場(chǎng)所，以及依據(jù)蟲害誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物尋找并捕食蚜蟲的過(guò)程中發(fā)揮作用;不同CpalOBP的氣味結(jié)合譜不同但具有一定的重疊，由此可以增加大草蛉嗅覺(jué)的氣味譜及其靈敏性。根據(jù)熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步進(jìn)行“Y，形管趨避活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)己酸葉醇酯、癸醛、蒎烯和2-己基-1-癸醇4種氣味對(duì)大草蛉具有顯著的引誘活性，而14種氣味物質(zhì)（丁酸反-2-己烯酯、

12、2-十五烷酮、十二烷、十一烷、乙酸壬酯、丁酸順-3-己烯酯、十三烷、十四烷、香葉丙基酮、2-十三烷酮、十一醛、辛醛、法尼醇和法尼烯）表現(xiàn)出顯著的驅(qū)避活性。鑒于法尼烯是蚜蟲的報(bào)警信息素，推測(cè)大草蛉能夠通過(guò)識(shí)別進(jìn)而避開法尼烯存在的區(qū)域以提高對(duì)蚜蟲的搜尋效率。 CpalOBP功能研究及生物活性氣味物質(zhì)的篩選，為害蟲的“push-pull”策略的開發(fā)和應(yīng)用提供了重要支撐。
　　5.中華通草蛉氣味結(jié)合蛋白的功能研究
　　采用原核表達(dá)技

13、術(shù)成功表達(dá)并純化了6個(gè)中華通草蛉CsinOBP，并通過(guò)熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)對(duì)這6個(gè)CsinOBP與85種氣味物質(zhì)的結(jié)合能力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，不同CsinOBP的氣味結(jié)合譜不同，CsinOBP4與所測(cè)氣味物質(zhì)均無(wú)明顯的結(jié)合能力;CsinOBP2、6和9的結(jié)合譜極窄，僅分別結(jié)合1種氣味物質(zhì)(Ki＜20μM); CsinOBP1的結(jié)合譜相對(duì)較寬，與8種氣味物質(zhì)有較高的結(jié)合能力(Ki＜20μM);CsinOBP10的結(jié)合譜最廣，可以結(jié)合21種氣味

14、物質(zhì)(Ki＜20μM)。由于CsinOBP1與水稻和大豆的揮發(fā)物十二烷、2-己基-1-癸醇、β-石竹烯和反式石竹烯以及蚜蟲報(bào)警信息素法尼烯等有著極強(qiáng)的結(jié)合能力，推測(cè)其在中華通草蛉尋找獵物寄主植物、棲息地和產(chǎn)卵場(chǎng)所以及捕食蚜蟲過(guò)程中發(fā)揮作用。與CpalOBP10有較強(qiáng)結(jié)合能力的21種氣味物質(zhì)中有多種植物揮發(fā)物及棉花的誘導(dǎo)揮發(fā)物苯乙醛和丁酸葉醇酯，因此CsinOBP10可能在中華通草蛉通過(guò)誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物來(lái)搜尋獵物昆蟲的過(guò)程中發(fā)揮的作用。<

15、br>　　6.棉鈴蟲氣味結(jié)合蛋白的分子鑒定及功能研究
　　通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)，首次從棉鈴蟲中鑒定得到兩個(gè)Minus-C OBP基因(HarmOBP17和18)。qPCR結(jié)果顯示，HarmOBP17在低齡幼蟲和成蟲中高表達(dá)，而HarmOBP18只在成蟲期高表達(dá);HarmOBP17主要在雌雄蟲觸角和雌蟲頭部高表達(dá)，而HarmOBP18只在雌蟲翅中高表達(dá)。采用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)對(duì)2個(gè)OBP與85種氣味物質(zhì)在不同pH下的結(jié)合能力進(jìn)行測(cè)定，

16、結(jié)果表明2個(gè)蛋白均與β-紫羅蘭酮的結(jié)合能力最強(qiáng)(Ki＜13μM)。令人意外的是，2個(gè)OBP與氣味物質(zhì)在pH=5.0的條件下的結(jié)合能力比pH為7.4和10.0時(shí)強(qiáng)，暗示著在HarmOBP17和18中可能存在另外一種不同的配基釋放機(jī)制。另外，對(duì)HarmOBP17和18進(jìn)行了C-末端突變，試驗(yàn)說(shuō)明C-末端在HarmOBP17和18結(jié)合和釋放配基的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。
　　7.棉鈴蟲化學(xué)感受蛋白的分子鑒定及功能研究
　　通過(guò)棉鈴蟲

17、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和構(gòu)建cDNA文庫(kù)，共鑒定得到棉鈴蟲24個(gè)HarmCSP基因，并對(duì)它們的組織表達(dá)譜和生理功能進(jìn)行了研究。qPCR結(jié)果表明，HarmCSP基因表現(xiàn)出不同組織表達(dá)譜，暗示不同HarmCSP具有不同的生理功能。其中，HarmCSP6、9、18和19主要在嗅覺(jué)組織或性腺中表達(dá)，因此采用原核表達(dá)和熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，對(duì)它們的功能進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示4個(gè)HarmCSP對(duì)85種所測(cè)氣味物質(zhì)均無(wú)結(jié)合能力，但是HarmOBP6與棉鈴蟲性信息素組分

18、及前體有很強(qiáng)的結(jié)合能力(Ki＜1.5μM)，說(shuō)明HarmCSP6可能具有識(shí)別棉鈴蟲性信息素組分的功能。進(jìn)一步對(duì)HarmCSP6在成蟲觸角中的感器分布進(jìn)行了定位，發(fā)現(xiàn)HarmCSP6在雌雄蟲觸角的長(zhǎng)毛型感器下的細(xì)胞中表達(dá)，支持了HarmCSP6參與感受棉鈴蟲性信息素功能的推測(cè)。
　　綜上所述，本文從大草蛉、中華通草蛉和棉鈴蟲中鑒定得到了大量的嗅覺(jué)相關(guān)基因，同時(shí)采用系統(tǒng)發(fā)育分析、mRNA豐度分析、半定量分析、熒光定量分析、配基結(jié)合分析