兩種過(guò)氧化物還原酶在日本囊對(duì)蝦先天免疫中的功能研究.pdf

1、先天免疫是生物體在長(zhǎng)期的進(jìn)化中獲得的一種抵御外界病原微生物入侵的天然防御機(jī)制，是宿主啟動(dòng)免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)。無(wú)脊椎動(dòng)物僅具備先天免疫系統(tǒng)，因而是研究先天免疫應(yīng)答機(jī)制的理想生物。無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫研究在以果蠅和線蟲為代表的模式生物中取得了較大的進(jìn)展，獲得了深入的認(rèn)識(shí)。近年來(lái)，以對(duì)蝦為代表的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，但也頻繁遭受病害的侵襲。因此，需要深入研究對(duì)蝦的先天免疫應(yīng)答機(jī)制，為相關(guān)產(chǎn)業(yè)的病害防控提供理論參考與技術(shù)支持。
　　研究

2、的科學(xué)問(wèn)題及意義：
　　已知，在需氧生物中，由過(guò)氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶等組成的抗氧化酶系統(tǒng)在生物體的先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要功能。近期的研究成果表明，過(guò)氧化物還原酶(Peroxiredoxin，Prx)，作為一類多功能的、廣泛分布的硫醇依賴性的抗氧化酶，可能參與先天免疫應(yīng)答。但是，其在先天免疫應(yīng)答中的具體功能和發(fā)揮作用的分子機(jī)制尚不明確。因此，在本論文中我們選擇具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的無(wú)脊椎動(dòng)物日本囊對(duì)蝦作為實(shí)驗(yàn)材料，深入研究Prx1

3、亞型在對(duì)蝦抗白斑綜合癥病毒(White spot syndrome virus，WSSV)先天免疫和1-Cys Prx6亞家族蛋白在對(duì)蝦抗細(xì)菌先天免疫中的功能及其作用機(jī)制，以期能夠揭示這類抗氧化蛋白在動(dòng)物先天免疫應(yīng)答中的功能與分子機(jī)理，為深入理解動(dòng)物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)在免疫應(yīng)答中的功能和對(duì)蝦病害防控提供幫助。
　　研究結(jié)果：
　　1、MjPrx1通過(guò)介導(dǎo)NF-κB同源蛋白MjDorsal二聚化，促進(jìn)MjDorsal與病毒ie1

4、啟動(dòng)子的結(jié)合，促進(jìn)WSSV在對(duì)蝦體內(nèi)的復(fù)制
　　受WSSV感染后，MjPrx家族成員在日本囊對(duì)蝦鰓組織中呈現(xiàn)不同的表達(dá)變化，其中MjPrx1呈現(xiàn)出最為顯著的上調(diào)表達(dá)。RNA干擾實(shí)驗(yàn)表明，干擾Mjprx基因的表達(dá)能夠提高WSSV感染對(duì)蝦的存活率，抑制WSSV在對(duì)蝦體內(nèi)的復(fù)制;而注射純化的MjPrx1重組蛋白則能夠降低WSSV感染對(duì)蝦的存活率，促進(jìn)WSSV在對(duì)蝦體內(nèi)的復(fù)制，表明在對(duì)蝦體內(nèi)MjPrx1發(fā)揮促進(jìn)WSSV復(fù)制的功能。免疫細(xì)胞

5、化學(xué)和染色質(zhì)共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)，干擾Mjprx1基因的表達(dá)能夠抑制WSSV感染引起的核因子κB(Nuclear factor kappaB，NF-κB)同源蛋白MjDorsal的核移位及其與病毒極早期基因ie1啟動(dòng)子的結(jié)合活性。免疫共沉淀結(jié)果顯示:在對(duì)蝦體內(nèi)，MjPrx1能夠與MjDorsal相互作用，形成二硫鍵連接的異二聚體形式;而且WSSV感染能夠顯著促進(jìn)二者的相互作用。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，MjPrx1蛋白能夠與MjDorsal中的Rel同源

6、結(jié)構(gòu)域(Rel homolog domain，RHD)以二硫鍵連接的方式形成異源二聚體，并介導(dǎo)MjDorsalRHD結(jié)構(gòu)域形成二硫鍵連接的同源二聚體。點(diǎn)突變和重組蛋白Pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MjPrx1的Cys51殘基對(duì)MjPrx1與MjDorsalRHD結(jié)構(gòu)域的相互作用有重要影響。并且，對(duì)蝦體內(nèi)注射不同形式的MjPrx1突變體蛋白的實(shí)驗(yàn)表明，Cys51殘基突變的MjPrx1突變體蛋白不能再發(fā)揮促進(jìn)WSSV復(fù)制的功能，表明此氨基酸在

7、MjPrx1蛋白發(fā)揮促進(jìn)病毒復(fù)制的功能中具有重要作用。以上研究結(jié)果證實(shí):MjPrx1能夠通過(guò)與MjDorsal相互作用，介導(dǎo)其二聚化，促進(jìn)其活化入核，增強(qiáng)其與WSSV極早期基因ie1啟動(dòng)子的結(jié)合活性，促進(jìn)WSSV在日本囊對(duì)蝦體內(nèi)的復(fù)制。
　　2、1-Cys亞型Prx6通過(guò)維持對(duì)蝦體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)抗菌膚基因的表達(dá)，在對(duì)蝦抗細(xì)菌免疫中發(fā)揮作用
　　鰻弧菌感染日本囊對(duì)蝦后，能夠引起對(duì)蝦不同組織中MjPrx6上調(diào)表達(dá)和過(guò)氧化氫

8、(H2O2)濃度升高。RNA干擾和鰻弧菌感染實(shí)驗(yàn)表明:干擾Mjprx6基因的表達(dá)引起對(duì)蝦存活率顯著降低、細(xì)菌清除能力下降，表明MjPrx6在對(duì)蝦抗細(xì)菌免疫中具有重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，干擾Mjprx6會(huì)引起對(duì)蝦體內(nèi)H2O2異常升高，并且能夠抑制細(xì)菌感染誘導(dǎo)的某些抗菌肽(antimicrobial peptides，AMP)基因的上調(diào)表達(dá)。向?qū)ξr體內(nèi)注射抗氧化劑NAC能夠降低Mjprx6干擾引起的H2O2異常升高，解除對(duì)AMP基因上調(diào)表

9、達(dá)的抑制作用。表明H2O2濃度可能在調(diào)節(jié)抗菌肽基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。向?qū)ξr體內(nèi)注射不同濃度的外源H2O2,模擬不同實(shí)驗(yàn)中對(duì)蝦體內(nèi)H2O2的濃度變化，結(jié)果表明:注射較低濃度的H2O2能夠促進(jìn)相應(yīng)的AMP基因表達(dá)，但對(duì)Mjprx6基因表達(dá)不產(chǎn)生影響;而較高濃度的H2O2則抑制AMP基因的表達(dá)，但誘導(dǎo)Mjprx6基因上調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果表明H2O2能夠以劑量依賴性的方式雙向調(diào)節(jié)AMP基因表達(dá)，并且誘導(dǎo)Mjprx6的上調(diào)表達(dá)。向Mjprx6干擾

10、組對(duì)蝦回補(bǔ)具有過(guò)氧化物還原酶活性的MjPrx6重組蛋白能夠顯著降低Mjprx6干擾引起的對(duì)蝦鰓組織H2O2異常升高，并修復(fù)Mjprx6干擾引起的對(duì)蝦細(xì)菌清除能力下降和AMP基因表達(dá)降低等異常表型;而注射無(wú)活性的MjPrx6C44S突變體則沒(méi)有相應(yīng)的效果。RNA干擾和細(xì)菌清除實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，由MjPrx6所調(diào)節(jié)的抗菌肽在對(duì)蝦抗細(xì)菌免疫中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果表明:MjPrx6能夠通過(guò)發(fā)揮過(guò)氧化物還原酶活性，防止細(xì)菌感染過(guò)程中對(duì)蝦體內(nèi)H2O

11、2的過(guò)量產(chǎn)生，將H2O2濃度維持在促進(jìn)AMP基因表達(dá)的適當(dāng)水平，促進(jìn)對(duì)蝦的抗細(xì)菌免疫反應(yīng)。
　　研究的創(chuàng)新點(diǎn)：
　　本論文主要研究了兩種Prx亞型在日本囊對(duì)蝦先天免疫中的功能與分子機(jī)理。研究創(chuàng)新點(diǎn)主要包括以下幾個(gè)方面:
　　(1)證明Prx1能夠與NF-κB同源蛋白MjDorsal相互作用，介導(dǎo)其形成二硫鍵連接的同源二聚體形式，促進(jìn)其活化入核，增強(qiáng)其與WSSV ie1啟動(dòng)子結(jié)合從而促進(jìn)病毒在對(duì)蝦體內(nèi)的復(fù)制;