淋球菌外膜蛋白NspA在大腸桿菌中高效表達(dá)及其性能的初步研究.pdf

1、目的：淋病是性傳播疾病中最常見、發(fā)病率排列第一的疾病；也是我國最常報道的性病之一，不僅發(fā)病人數(shù)最多，而且有逐年上升趨勢，其感染還有增加HIV易感性的可能。目前常用的抗生素治療雖然可以縮短淋球菌感染持續(xù)的時間并減少其傳播，但近年來淋球菌耐藥菌株的增多和新型耐藥株的不斷出現(xiàn)，這一策略已經(jīng)陷入困境和危機(jī)，因此迫切需要尋求新的預(yù)防和治療方法，而疫苗的研究是首選的策略之一。迄今為止，國內(nèi)外尚無預(yù)防淋病的疫苗問世。最近對奈瑟菌外膜蛋白NspA的研究

2、發(fā)現(xiàn)，NspA具有高度的抗原保守性，其保守性高于同樣是淋球菌候選抗原的PI蛋白。NspA蛋白持續(xù)表達(dá)暴露在細(xì)胞表面，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗NspA抗體有溶菌活性，因此，NspA是一個潛在的制備淋球菌疫苗的候選抗原，可望用于制備成防治淋病的疫苗。 本研究通過擴(kuò)增淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)外膜蛋白nspA(Neisseria surface protein A)基因，構(gòu)建pET-NspA重組子，實現(xiàn)NspA重組蛋

3、白在大腸桿菌中的高效表達(dá)，通過金屬離子親和層析純化表達(dá)蛋白，免疫動物獲得多克隆抗體血清，并對抗血清的性質(zhì)進(jìn)行初步研究，為后續(xù)研究淋球菌NspA的免疫學(xué)性能、相應(yīng)的抗體制各及疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)，特別是為研制適合我國流行情況的相關(guān)疫苗奠定了堅實的基礎(chǔ)。 方法：本研究分為三部分。 1．淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae)外膜蛋白NspA原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及序列分析根據(jù)nspA基因序列特性，設(shè)計三套引物，用

4、PCR方法自淋球菌基因組中擴(kuò)增nspA目的片段。利用限制性內(nèi)切酶剪切產(chǎn)生的粘性末端將擴(kuò)增所得片段與原核表達(dá)質(zhì)粒載體pET30c(+)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-NspA，首先轉(zhuǎn)入克隆宿主E.Coli DH5a，利用卡那霉素抗性篩選陽性克隆，質(zhì)粒小量提取后，雙酶切及基因序列測定鑒定重組質(zhì)粒。用blastn軟件將測定所得的陽性重組子的基因序列與Genbank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行同源性比較，尋找相似序列；用DNAssist 2.0軟件進(jìn)行2條淋球菌

5、標(biāo)準(zhǔn)株ndpA基因序列間的同源性比較，分析淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株29400 29403與Genbank已報道的淋球菌，zspA基因序列問差異；同時使用blastp軟件在Genbank中搜索與本研究中2條序列的氨基酸序列高度同源序列，并比較兩淋球菌NspA氨基酸序列間的同源性。利用相關(guān)生物軟件分析所構(gòu)建的三套重組子的開放讀碼框架(0RF)和預(yù)期分子量(Mw)，使用RasWin M0lecular Graphics Windows Version

6、2.6、SWISS-MODEL等蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件預(yù)測NspA蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級構(gòu)型。將所得預(yù)測結(jié)果與已有研究結(jié)果進(jìn)行分析比較，分析所得融合蛋白的立體構(gòu)象及其暴露于膜外的抗原決定簇的幾種100p結(jié)構(gòu)區(qū)，為下一步研究奠定理論基礎(chǔ)。 2.NspA融合蛋白的表達(dá)及純化第一部分所得重組質(zhì)粒pET-NspA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)NspA重組蛋白表達(dá)，優(yōu)化重組蛋白的表達(dá)條件，SDS-PAGE分析目的蛋

7、白的表達(dá)情況；篩選溶解包涵體的條件和獲取融合蛋白粗提取物條件，選擇鎳金屬離子親和層析對NSpA重組蛋自進(jìn)行純化，優(yōu)化離心法純化重組蛋自各項條件，SDS-PAGE檢測鶯組蛋芻純度及其分子量；使用抗His-Tag標(biāo)簽的單克隆抗體以wrestem blot法鑒定鶯導(dǎo)表達(dá)的重組NspA蛋白。 3、淋球菌外膜蛋白NspA融合蛋白的免疫原性研究 根據(jù)第二部分篩。的鎳金屬離子親和層析純化NSpA重組蛋白的條件，大量純化目的重組蛋，SDS-P

8、AGE檢測重組蛋白純度及其分子量；選擇新西蘭大白兔和ICR小 按如下方式制各兩種動物源性的多克隆抗血清。常規(guī)免疫方法，腹腔注 方式免疫ICR小鼠；常規(guī)免疫方法和快速免疫方法，以皮下多點(diǎn)注射方式 !新西蘭大白兔。加強(qiáng)免疫三次后試血，效價達(dá)到要求后，心臟采血方式 兔血清，眼球摘除法收集小鼠血清。多克隆抗體的效價用間接ELISA 測定；以Western blot法檢測多克隆抗體的反應(yīng)性。所收集血清在加入 jNaN3后小管分裝，于-7

9、0℃保存。 結(jié)果 1．成功構(gòu)建了淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株nspA基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-NspA，質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，得到表達(dá)載體片段(5.kb)和目的基因片段(0.4～0.5kb)，與預(yù)期結(jié)果相符。 2．兩淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株的nspA基因經(jīng)測序，目的基因全長471bp，在Genbank數(shù)據(jù)庫中搜索到NspA-29400和29403的相似序列，與Genbank所公布淋球菌FA 1090的nspA基因序列比較，NspA-2

10、9400與其僅存在一個堿基的差異，同源性為99％；NspA-29403與之的同源性為100％；相應(yīng)的氨基酸序列與Genbank數(shù)據(jù)庫中淋球菌NspA氨基酸序列的同源性均在98％以上。 3．使用第一套引物獲得的預(yù)期融合基因產(chǎn)物長度為544bp，相應(yīng)的融合蛋白長為228個氨基酸，其預(yù)測分子量為24.17kD，該融合產(chǎn)物以pET系統(tǒng)的起始密碼起始，包括nspA基因的前導(dǎo)序列和一個pET載體的5’端6×HisTag，以nspA基因的終止

11、密碼終止；使用第二套引物獲得的預(yù)期融合基因產(chǎn)物長度為487bp，相應(yīng)的融合蛋白長為209個氨基酸，其預(yù)測分子量為22.65kD，該融合產(chǎn)物以pET系統(tǒng)的起始密碼起始，去除了nspA基因的前導(dǎo)序列，包含一個pET載體的5’端6×His Tag，以nspA基因的終止密碼終止；使用第三套引物獲得的預(yù)期融合基因產(chǎn)物長度為484bp，相應(yīng)的融合蛋白長為222個氨基酸，其預(yù)測分子量24.44kD，該融合產(chǎn)物以pET系統(tǒng)的起始密碼起始，去除了nspA

12、基因的前導(dǎo)序列，包含pET載體的二個6×HisTag(5’端及3’端)，以pET的終止密碼終止。 4．本研究所得NspA蛋白質(zhì)序列包含4個完整的暴露于膜外的loop結(jié)構(gòu)，loop區(qū)域是主要的抗原決定簇聚集的場所，其中保護(hù)性抗體與NspA蛋白的主要結(jié)合位點(diǎn)位于該蛋白的loop2和loop3區(qū)；預(yù)測的NspA-29400和29403蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)均為富含β-片層的環(huán)形筒狀結(jié)構(gòu)，暴露于膜外的四個環(huán)區(qū)構(gòu)成了一個高度疏水的凹槽，符合已有報

13、道。 5．SDS-PAGE結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，第一套引物構(gòu)建的重組子經(jīng)誘導(dǎo)后，在預(yù)期分子量大小處未出現(xiàn)表達(dá)條帶；經(jīng)第二套、第三套引物構(gòu)建的含pET-NspA的表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)在預(yù)期分子量大小處均出現(xiàn)明顯的表達(dá)條帶，所優(yōu)化的誘導(dǎo)條件為1mmol/l的IPTG，37℃，2h后，表達(dá)量達(dá)最大。 6．使用抗His-Tag 單克隆抗體檢測兩組誘導(dǎo)表達(dá)成功的重組蛋白，BL21-pET-NspA-294

14、00-2、BL21-pET-NspA-29403-2工程菌誘導(dǎo)所得蛋白不能被識別，BL21-pET-NspA-29403-3工程菌誘導(dǎo)所得蛋白可被該抗體識別。經(jīng)過進(jìn)一步分析，第二套引物構(gòu)建的重組蛋白在進(jìn)行Western blot檢測時，可能是由于樣品處理過程中5’端His-Tag丟失而不被檢測，后續(xù)的鎳親和層析純化重組蛋白的成功間接說明了該重組蛋白含有His-Tag。 7．選擇含8mol／L尿素的50mmol／LPBS緩沖液(p

15、H7.4)變性條件下溶解所得的以包涵體形式存在的重組蛋白，采用超聲破碎的方法裂解細(xì)胞粗提融合蛋白，優(yōu)化的超聲條件為功率180W，4s工作，6s間隙，每次工作50次，直到破碎液變清亮。 8．優(yōu)化了變性條件下，以FF膠通過大量離心法純化兩套引物構(gòu)建的工程菌29403-423和29403-211重組NspA蛋白的條件，即采取含5mM咪唑的Bindingbuffer，含10mM咪唑的Wash buffer洗脫5～6次，最后以含300mM

16、咪唑的Elute buffer洗脫目的蛋白，獲得足夠量的純度較高的NspA融合蛋白。 9．以純化蛋白免疫ICR小鼠和新西蘭大白兔，獲得足量的具備較高效價的兩種動物源性的多克隆抗血清；通過Western blot檢測其反應(yīng)性，多克隆抗體可以與相應(yīng)的誘導(dǎo)蛋白和純化蛋白反應(yīng)，并能與不含His-Tag的重組NsoA反應(yīng)，該研究為進(jìn)一步研究針對NspA抗體性能研究等奠定了基礎(chǔ)。 結(jié)論：成功構(gòu)建了淋球菌外膜蛋白NspA三套引物的原核

17、表達(dá)重組質(zhì)粒oET-NspA，實現(xiàn)了淋球菌NspA基因在原核細(xì)胞中的高效表達(dá)。通過序列分析，發(fā)現(xiàn)不同淋球菌菌株間的nspA基因同源性高于本實驗室前期構(gòu)建的外膜蛋白PI，且與腦膜炎奈瑟菌的nspA基因的同源性也高達(dá)98％。結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白的主要抗原決定簇集中在其位于膜外的四個loop區(qū)中的L<,1>和L<,2>區(qū)，下一步研究重點(diǎn)可集中在這兩個區(qū)域。使用鎳金屬離子親和層析，通過離心法可在變性條件下簡便快速地得到純度較高的NspA融合