重慶市家畜大腸桿菌O157致病性及外膜蛋白的初步研究.pdf

1、腸出血性大腸桿菌EHEC O157:H7(Entero-hemorrhagic E．Coli，EHEC O157:H7)引起的感染性腹瀉是近年來(lái)危害極其嚴(yán)重的腸道傳染病。它除引起感染性腹瀉、出血性腸炎(HC)外，還可引發(fā)溶血性尿毒綜合征(HUS)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等并發(fā)癥。自該菌被分離鑒定以來(lái)，已在國(guó)內(nèi)外引起多次爆發(fā)與流行。直至2006和2007年，美國(guó)和日本仍有該菌引起人HUS甚至死亡的報(bào)道。大腸桿菌O157也大面積存

2、在于我國(guó)，且呈多因素感染之勢(shì)。我國(guó)己將EHEC列為21世紀(jì)可能對(duì)國(guó)人衛(wèi)生健康有重大影響的12種病原微生物之一。因此進(jìn)一步加強(qiáng)EHEC O157:H7的診、防、治研究已迫在眉睫。由于O157的爆發(fā)流行以及在治療上的無(wú)奈，疫苗研究就顯得尤其緊迫。外膜蛋白(Omp)是大腸桿菌的一個(gè)重要毒力因子，其涉及大腸桿菌病的致病機(jī)理及免疫機(jī)理，這預(yù)示著Omp對(duì)大腸桿菌病的防治有廣闊的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)對(duì)重慶地區(qū)家畜大腸桿菌O157的致病性、遺傳相關(guān)性、Om

3、p進(jìn)行初步研究，旨在為該菌診、防、治研究提供重要的科學(xué)依據(jù)。 1.大腸桿菌O157的致病性分析 目的：了解和比較重慶市家畜大腸桿菌O157分離株間的致病性。方法：從重慶市6個(gè)地區(qū)的養(yǎng)殖場(chǎng)分離劍的11株大腸桿菌O157對(duì)小白鼠進(jìn)行感染試驗(yàn)，取小鼠肝、脾、腎、腸等病變組織制備病理切片，光鏡觀察切片。結(jié)果：11株O157分離株均能感染致死小鼠，引起小鼠腸壁變薄充血，腸粘膜壞死脫落，肝腎淤血變性壞死，脾出血，肺淤血等組織病變。結(jié)

4、論：重慶市大腸桿菌O157分離株均具有損害小鼠各臟器并感染致死的能力，且各菌株引起小鼠病變較為一致，病變程度有一定的差異。 2.大腸桿菌O157毒力基因stx2/stx2c的檢測(cè) 目的：了解O157分離株是否攜帶stx2及stx2c亞基因。方法：用PCR技術(shù)擴(kuò)增stx2/stx2c基因B亞基的保守序列，克隆至pMD18-T載體進(jìn)行測(cè)序和序列比較分析。結(jié)果：除了分離自榮昌/永川的RY8菌株，其他菌株未擴(kuò)增出stx2/stx

5、2c B亞基。該序列與stx2，stx2c，stx2d，stx2e，stx2fB亞基同源性分別為99.3％、94.8％、86.3％、84.5％、80％。結(jié)論：首次檢測(cè)出重慶市有攜帶高致病性stx2基因的O157菌株存住，故應(yīng)加強(qiáng)本地人腸桿菌O157檢測(cè)工作，防患于未然。 3.人腸桿菌O157外膜蛋白的SDS-PAGE分析 目的：了解O157分離株遺傳相關(guān)性及主要Omp的免疫原性。方法：采用超聲波破碎、N-十二烷基肌氨酸處

6、理和超速離心技術(shù)提取主要Omp，用Omp分型法對(duì)分離株Omp進(jìn)行分型；提取的Omp免疫家兔自制抗血清，用免疫印記試驗(yàn)(westernblot)分析菌株Omp的免疫原性。結(jié)果：SDS-PAGE結(jié)果將分離株分為3個(gè)Omp型：YB2菌株為Omp-A型；YB1、YB3、YB4、YB5、YB6、YB8、YB9、’YB10、YB11菌株為Omp-B型；YY7菌株為Omp-C型。3種Omp型代表株主要Omp均能產(chǎn)生與之結(jié)合的抗體，且Sakai標(biāo)準(zhǔn)株與