超正電荷ZFN融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及其功能的初步研究.pdf

1、人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV)是一種感染人類免疫系統(tǒng)的病毒，可通過破環(huán)人的淋巴細(xì)胞影響細(xì)胞免疫和體液免疫過程，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)癱瘓，對人類健康存在極大威脅。最新的研究結(jié)果表明，CCR5受體是HIV進(jìn)入T細(xì)胞的共受體，因此破壞基因組中的CCR5基因或阻止CCR5基因表達(dá)成了阻斷HIV侵染人類T細(xì)胞的一種新途徑。
　　本文運用Ni磁珠與Co磁珠親和層析技術(shù)純化出超正電荷ZFN融合蛋白，

2、驗證出該蛋白具有切割CCR5基因的活性，從而為后續(xù)阻斷HIV進(jìn)入T細(xì)胞以及HIV基因治療提供了新思路。本文主要研究結(jié)果如下：
　　1.超正電荷ZFN融合蛋白的表達(dá)
　　運用IPTG對轉(zhuǎn)化了pET22b-(+)36GFP/ZFNL和pET22b-(+)36YFP/ZFNR質(zhì)粒的兩種菌株進(jìn)行誘導(dǎo)，然后分別在不同溫度和不同IPTG濃度的條件下過夜培養(yǎng)，次日分別收集菌體進(jìn)行超聲破碎，SDS-PAGE檢測蛋白分布情況。實驗結(jié)果確定16

3、℃，0.5mM IPTG誘導(dǎo)是融合蛋白(+)36GFP/ZFNL和(+)36YFP/ZFNR表達(dá)的最適條件。
　　2.超正電荷ZFN融合蛋白純化條件的摸索
　　1）通過Ni磁珠親和層析技術(shù)純化+36GFP/ZFNL融合蛋白，發(fā)現(xiàn)高鹽裂解液條件有利于此融合蛋白掛柱，后續(xù)洗脫可以有效獲得該融合蛋白。
　　2）+36YFP/ZFNR融合蛋白同樣在高鹽裂解液條件下有利于其掛柱，但后續(xù)洗脫困難，推測該融合蛋白與Ni磁珠結(jié)合過于牢

4、固。然后運用了Co磁珠和已使用兩次的Ni磁珠對該融合蛋白進(jìn)行純化，發(fā)現(xiàn)該方法可以有效獲得+36YFP/ZFNR融合蛋白。
　　3.重組質(zhì)粒Pet22b/CCR5的構(gòu)建
　　以HCC1954細(xì)胞中的基因組DNA作為PCR擴增模板，有效獲得人CCR5基因。隨后將CCR5目的基因連接到質(zhì)粒載體Pet22b，經(jīng)菌落PCR，雙酶切及基因測序等方法驗證了CCR5基因無突變。
　　4.超正電荷ZFN融合蛋白活性檢測
　　將重組

5、質(zhì)粒pET22b/CCR5與上述純化的兩個超正電荷ZFN融合蛋白在37℃共孵育1h后，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)隨著超正電荷ZFN融合蛋白摩爾量的增加，重組質(zhì)粒pET22b/CCR5被切割成線性質(zhì)粒產(chǎn)物的量也在增加，表明ZFN蛋白活性功能在增強。同時，發(fā)現(xiàn)當(dāng)超正電荷ZFN融合蛋白摩爾量增加到7nM后，該蛋白會對重組質(zhì)粒pET22b/CCR5產(chǎn)生非特異性切割。
　　綜上所述，我們在大腸桿菌中成功表達(dá)了超正電荷ZFN融合蛋白