體內(nèi)和體外高效表達(dá)大腸桿菌水通道蛋白Z.pdf

1、大腸桿菌水通道蛋白Z(AqpZ)水選擇專一性強(qiáng)、滲透性高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，所以AqpZ在仿生廢水回收以及海水淡化等領(lǐng)域具有潛在的重要應(yīng)用價(jià)值。但是由于AqpZ強(qiáng)烈疏水性會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性，使得在傳統(tǒng)大腸桿菌體系表達(dá)量?jī)H僅只有2.5 mg/l，很難滿足制備基于水通道蛋白的水過(guò)濾裝置的需求。
　　 本工作的目的是運(yùn)用融合表達(dá)策略和無(wú)細(xì)胞體系表達(dá)策略，高效制備功能性AqpZ，為制備新型水過(guò)濾裝置奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并發(fā)展一個(gè)具有普遍意義的膜蛋白高效

2、表達(dá)技術(shù)。
　　 首先采用融合表達(dá)策略，即在目標(biāo)膜蛋白的上游引入親水性分子伴侶，構(gòu)建帶有不同融合標(biāo)簽的體內(nèi)表達(dá)載體。發(fā)現(xiàn)pMAL-P2-AqpZ對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的影響最小，融合蛋白的表達(dá)水平最高，進(jìn)一步優(yōu)化誘導(dǎo)條件(包括誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)后培養(yǎng)時(shí)間)，表達(dá)量可高達(dá)200 mg/l。
　　 由于AqpZ疏水性會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性，隨后采用沒(méi)有生長(zhǎng)要求的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系。構(gòu)建的一系列帶有不同N端序列的無(wú)細(xì)胞體

3、系表達(dá)載體中，pIVEX2.4c-AqpZ為最佳表達(dá)載體。由于無(wú)細(xì)胞體系缺少膜蛋白正確折疊所需要的疏水環(huán)境，AqpZ都是以沉淀的形式表達(dá)。首先采用去污劑重懸的模式來(lái)制備可溶性AqpZ，然而采用的10余種去污劑均不能有效溶解AqpZ沉淀?？紤]到無(wú)細(xì)胞體系的開(kāi)放性特點(diǎn)，采用直接添加去污劑的模式，發(fā)現(xiàn)Brij78為最優(yōu)去污劑，在112xCMC最佳工作濃度下，可溶表達(dá)水平約為530 mg/l。此外，還研究了直接添加脂質(zhì)體的模式，在實(shí)驗(yàn)最高脂質(zhì)體

4、濃度(5 mg/ml)下，整合到磷脂膜的AqpZ表達(dá)水平達(dá)到470 mg/l。
　　 在無(wú)細(xì)胞體系表達(dá)AqpZ時(shí)發(fā)現(xiàn)，mRNA翻譯起始區(qū)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)抑制翻譯的有效啟動(dòng)，使得不帶有N端標(biāo)簽的AqpZ表達(dá)量較低，所以開(kāi)展了無(wú)細(xì)胞體系高效表達(dá)AqpZ新策略方面的研究。首先采用雙順?lè)醋硬呗裕m然構(gòu)建的雙順?lè)醋淤|(zhì)粒能夠有效提高AqpZ在大腸桿菌體系的表達(dá)水平，但這些質(zhì)粒并不能在無(wú)細(xì)胞體系實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。隨后采用信號(hào)肽策略，構(gòu)建帶有不同信號(hào)