胃癌CD40+MDSC亞群的鑒定及生物學(xué)功能初步分析.pdf

1、目的：Gr-1+CD11b+髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)是腫瘤微環(huán)境中重要的免疫抑制細(xì)胞,其在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因MDSC具異質(zhì)性,生物學(xué)作用復(fù)雜,限制了研究者們對MDSC全面深入的了解,因此鑒定MDSC細(xì)胞亞群是探討該群細(xì)胞生物學(xué)功能的重要前提。本研究擬鑒定MDSC亞群并探討其生物學(xué)功能,為胃癌免疫干預(yù)治療提供新的策略。
　　方法：腫瘤細(xì)胞系皮下種植構(gòu)建

2、C57BL/6小鼠荷瘤模型;流式細(xì)胞術(shù)動態(tài)檢測荷瘤小鼠脾臟和腫瘤組織浸潤MDSC的累積水平及其表面CD40的表達水平。體外功能實驗中,以CD40激發(fā)型抗體刺激MDSC培養(yǎng)24hr后,以Gr-1抗體、CD11b抗體、Annexin V標(biāo)記,流式分析CD40信號對MDSC凋亡的影響率。采用流式細(xì)胞分選技術(shù)從胃癌荷瘤小鼠脾臟細(xì)胞中分選出CD40+和CD40-Gr-1+CD11b+MDSC,細(xì)胞甩片技術(shù)離心涂片后,以Wright染色觀察兩亞群細(xì)

3、胞形態(tài);基因芯片技術(shù)篩選兩亞群關(guān)鍵差異性分子及信號通路的差異性,并以實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)進一步確認(rèn)基因芯片結(jié)果。
　　結(jié)果：(1)本實驗發(fā)現(xiàn)荷瘤小鼠MDSC表達CD40分子,且表達水平高于正常小鼠。在胃癌模型中,隨著腫瘤的生長荷瘤小鼠脾臟與腫瘤組織中MDSC的累積水平逐漸升高,而MDSC表面CD40的表達則逐漸降

4、低,呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson’s Correlation)顯示:脾臟及腫瘤組織中MDSC的累積水平均與腫瘤進展呈正相關(guān)(脾臟:r=0.9318,p<0.0001;腫瘤:r=0.9169,p<0.0001);MDSC表面CD40的表達水平與其累積水平呈負(fù)相關(guān)(脾臟:r=-0.8690,p=0.0002;腫瘤:r=-0.8673, p=0.0003)。凋亡檢測發(fā)現(xiàn)CD40激發(fā)型抗體能誘導(dǎo)MDSC凋亡,其中腫瘤組織浸潤MDS

5、C的凋亡率(mean±SEM,％)由71.37±2.68被誘導(dǎo)至79.09±3.29,差異具統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.0352);脾臟來源的MDSC凋亡率(mean±SEM,％)由25.43±10.45誘導(dǎo)至32.30±10.27,差異具統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.0167)。(2)胃癌荷瘤小鼠脾臟中Gr-1+CD11b+MDSC以CD40為標(biāo)記分子可分為兩個亞群:CD40-MDSC和CD40+MDSC。形態(tài)學(xué)顯示CD40-MDSC以環(huán)形核、分葉核和

6、多形核幼稚的粒細(xì)胞為主,核質(zhì)比較大。CD40+MDSC多為圓形和橢圓形核,核質(zhì)比較大,主要是幼稚單核細(xì)胞。實時熒光定量PCR提示與CD40-MDSC比較,CD40+MDSC分泌TNF-α、IL-6、IL-12、IL-10、IL-1β、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)及精氨酸酶(arginase,Arg)水平增高,其中以PGE2(Foldchange=7.29)及Arg(Foldchange=3.12)的上調(diào)具有

7、統(tǒng)計學(xué)意義(Foldchange≥2.0)。除此之外,這兩群細(xì)胞一些重要免疫抑制表型及免疫趨化遷移分子的表達也具有廣泛差異,如CD83、FMS樣的酪氨酸激3(fms-like tyrosine kinase,FLT3)、CXC趨化因子配體10(CXCL10)、CXC趨化因子受體5(CXCR5)和CXC趨化因子配體9(CXCL9)在CD40+MDSC均顯著高于CD40-MDSC(Foldchange≥2.0)。
　　結(jié)論：(1)荷瘤

8、小鼠MDSC表面表達CD40分子,且其表達水平高于健康小鼠;然而在胃癌模型中CD40表達水平隨著腫瘤進展逐漸降低,與MDSC的累積水平呈負(fù)相關(guān);CD40可誘導(dǎo)MDSC的凋亡,MDSC表面CD40的下調(diào)誘導(dǎo)了MDSC的抗凋亡,可能是參與調(diào)節(jié)MDSC累積的機制之一。提示在腫瘤早期,MDSC上CD40誘導(dǎo)表達可以促進炎癥性反應(yīng),營造適合胃癌生長的炎性環(huán)境;隨著腫瘤進展CD40不斷降低,CD40介導(dǎo)MDSC凋亡的作用逐漸減弱,導(dǎo)致MDSC逐漸累