雞TIA-1和G3BP1在應激顆粒形成和抗病毒反應過程中的作用.pdf

1、當細胞暴露于各種環(huán)境應激條件下，如亞砷酸鹽，缺氧和熱休克時，細胞終止蛋白翻譯，在細胞質中形成儲存mRNA的顆粒，稱為應激顆粒（stress granule，SG）。SG是在應激條件下從解聚的多核糖體儲存位點釋放的mRNA，對選擇性翻譯是所必需的。當應激條件消失時，應激刺激的細胞內損傷得到修復，例如DNA損傷和錯誤折疊蛋白的積累。RNA結合蛋白T細胞內部抗原-1（TIA-1）和GTP酶激活蛋白SH3功能區(qū)結合蛋白1（G3BP1）是參與SG

2、形成的重要組件。作為對環(huán)境應激的一種保守應答反應， SG存在于各種物種中。然而，在雞細胞中SG形成以及TIA-1/G3BP1在雞SG裝配中的作用還沒有被闡明。本研究重點將對雞TIA-1/G3BP1的功能及其在病毒復制中的作用進行研究。
　　TIA-1在調節(jié)人類細胞中前mRNA剪接，mRNA翻譯和SG形成中發(fā)揮作用。在本研究中，我們克隆雞 TIA-1（cTIA-1），結果表明外源轉染cTIA-1促進人和雞細胞中經典SGs的形成。具有

3、氨基末端GFP標簽（ntGFP-cPRD）或Flag標簽（Flag-cPRD）的cTIA-1朊蛋白相關結構域cPRD的過表達誘導典型的SG的產生，說明cPRD參與了SG的聚集。然而，羧基末端GFP標簽（ctGFP-cPRD）cPRD誘導明顯較大的細胞質顆粒，并且不與內源性G3BP1共定位，CHX處理后仍保持穩(wěn)定不降解，這些結果表明這些顆粒不是典型的SGs，ctGFP標簽影響cPRD定位。在外界環(huán)境應激下，內源性cTIA-1被募集到的雞細

4、胞的SG中，在熱休克處理下，雞心臟中出現(xiàn)明顯SG顆粒。以上結果表明：cTIA-1在雞細胞中的經典SG形成中起作用，cPRD在SG聚集過程中發(fā)揮重要作用。
　　G3BP1是SGs的重要組件，能夠啟動組裝SGs形成多聚體。為掌握G3BP1在如何作用于雞細胞中SG形成，以及雞G3BP1（cG3BP1）在新城疫病毒（NDV）感染誘導SG形成過程中的作用，用NDV感染HeLa細胞，免疫熒光檢測內源性G3BP1的定位，結果表明G3BP1呈現(xiàn)典

5、型的點狀熒光，但不與病毒P蛋白共定位。將雞G3BP1分別轉染至HeLa，DF-1和CEF后，以不同應激處理之后均能在細胞中觀察到SG。外源轉染cG3BP1和各分段結構域后以不同應激處理之后觀察與內源性SG標志物共定位現(xiàn)象，結果發(fā)現(xiàn)G3BP1的A結構域（NTF2樣結構域）不能被招募到SGs中，并且抑制原有SGs的形成，D區(qū)為RNA結合結構域，單獨表達D區(qū)能夠誘導SG形成，說明cG3BP1的RNA結合結構域對聚集至關重要。最后轉染G3BP1