小G蛋白Rab6和Ran在對蝦和果蠅細胞吞噬及抗病毒中的作用.pdf

1、細胞吞噬是宿主消化病原的直接途徑，是生物體最古老、最基本的防衛(wèi)機制之一，它是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。無論是單細胞動物還是多細胞動物，都是通過吞噬活動保持自身穩(wěn)定和對外防御。吞噬是一個動態(tài)過程，肌動蛋白（actin）在空間聚合上的變化為細胞吞噬提供了動力，肌動蛋白骨架的變化影響吞噬的整個過程。肌動蛋白高度有序的聚合，依靠其他因子的調(diào)控，目前只發(fā)現(xiàn)小G蛋白Rho可以影響骨架蛋白聚合。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，小G蛋白Ran和Rab6可以通

2、過調(diào)節(jié)骨架蛋白進而調(diào)控吞噬，但是具體機制不清楚。在前期研究基礎上，本論文進一步研究Rab6和Ran調(diào)控細胞吞噬及其抗病毒的分子機理。
　　 由于對蝦沒有細胞系，所以在體內(nèi)研究目的蛋白的過量表達比較困難。質(zhì)粒轉入對蝦活體，除了具有導入質(zhì)粒的困難，質(zhì)粒本身啟動子的結構、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、mRNA的結構都會影響蛋白的表達。體外合成mRNA，不僅成本較高，而且mRNA及其不穩(wěn)定，容易降解。為了找到一種合適的對蝦體內(nèi)蛋白過量表達的方法，我們采

3、取體外重組表達綠色熒光蛋白(GFP)，純化透析后注射進入對蝦體內(nèi)。結果顯示，GFP能有效進入對蝦血細胞內(nèi)，分布于細胞質(zhì)中。該方法的建立為研究對蝦及其病毒的蛋白質(zhì)的功能奠定了基礎。
　　 本文研究結果顯示，在對蝦中，Rab6蛋白通過和肌動蛋白直接互作，影響肌動蛋白骨架的構象，進而調(diào)控細胞吞噬，抵抗對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的侵染。在對蝦中，當Rab6基因的表達被序列特異的siRNA抑制后，肌動蛋白的構象發(fā)生明顯變化，細胞骨架蛋

4、白actin由片層狀變成偽足狀，并且細胞吞噬病毒的活性顯著下降，吞噬病毒的速率降低，表明Rab6蛋白通過影響actin蛋白的構象調(diào)控細胞吞噬。本文采用果蠅S2細胞進行研究，發(fā)現(xiàn)Rab6蛋白對細胞吞噬的調(diào)控機制與對蝦中的結果相同。結果表明，在S2細胞中，當Rab6基因被序列特異的siRNA抑制表達后，細胞內(nèi)肌動蛋白的聚合程度明顯下降;Rab6基因過表達后，肌動蛋白聚合程度提高;在S2細胞中拯救Rab6基因表達時，細胞骨架形態(tài)也恢復正常。上

5、述結果說明，Rab6蛋白對肌動蛋白的聚合起非常重要的作用。有效的吞噬包括顆粒攝取和吞噬體的成熟過程，吞噬過程可分為趨化、吸附、吞入和消化殺菌四個階段。為了探討Rab6調(diào)控吞噬的具體階段，在果蠅S2細胞中，我們將Rab6蛋白和早期溶酶體標志蛋白(Rab5)、晚期溶酶體標志蛋白（LAMP）相比較，發(fā)現(xiàn)Rab6影響整個吞噬過程。結果表明，無論是顆粒攝取還是消化處理時期，無論是吞噬前期還是吞噬后期，Rab6基因被抑制后，細胞吞噬百分率及酸化百分

6、率都顯著下降。結果證明，Rab6影響肌動蛋白的構像，從而調(diào)控細胞吞噬的整個過程。將對蝦的Rab6序列進行同源比較，結果顯示對蝦的Rab6和果蠅、人類的Rab6分別具有88％和91％的同源性，且在結構域活性位點上很保守，說明在進化中，無論是脊椎動物還是無脊椎動物，Rab6基因很保守。因此，本文揭示的Rab6調(diào)控無脊椎動物細胞吞噬的機制在動物界中可能是普遍存在的一條簡單高效的吞噬調(diào)控方式，這為研究先天性免疫分子機制在脊椎動物中擴大了視野，我

7、們的研究為小G蛋白調(diào)控吞噬提供了新證據(jù)。
　　 廣泛的證據(jù)表明病毒的結構蛋白在病毒感染中起重要作用，但是關于宿主和病毒之間的蛋白互作研究很少。本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，WSSV病毒的VP466蛋白和宿主的Rab6蛋白、原肌球蛋白(tropomyosin)、肌動蛋白形成蛋白復合體。本文進一步研究揭示VP466是雙功能蛋白，可以介導兩條信號通路，一條是VP466通過與tropomyosin的互作有利于病毒復制，一條是宿主Rab6蛋白

8、與VP466互作后有利于宿主抗病毒免疫，且兩條通路最后的效應蛋白都是肌動蛋白。在VP466-Rab6-actin信號通路中，VP466是Rab6的GTPase激活蛋白，Rab6活性的提高導致actin聚合的加強，有利于細胞吞噬活性的增強。在VP466-tropomyosin-actin信號通路中，原肌球蛋白引導肌動蛋白變化，actin被病毒利用，有利于病毒自身的感染和裝配。研究結果表明，宿主Rab6蛋白和原肌球蛋白都結合在VP466上的

9、同一個區(qū)域(301-340)，所以WSSV病毒VP466蛋白介導的兩條通路實際上是一種競爭關系。越來越多的證據(jù)表明多功能蛋白存在于病原中，但是病毒中的多功能蛋白很少見。因此，我們的研究揭示了病毒多功能蛋白的存在，并且病毒蛋白可以競爭性被病毒本身或宿主利用，啟動兩條不同的通路，闡述了一種關于無脊椎動物病毒與宿主之間互作的新機制。
　　 Ran蛋白之前在對蝦體內(nèi)發(fā)現(xiàn)調(diào)控吞噬，但是具體過程不清楚。為了闡明其調(diào)控機理，我們以無脊椎動物模

10、式生物果蠅S2細胞為研究對象，開展相關研究。本文研究發(fā)現(xiàn)，在果蠅S2細胞吞噬其病毒DCV過程中，Ran基因上調(diào)表達，暗示Ran蛋白可能參與果蠅抗病毒感染的先天性免疫。結果表明，當Ran基因表達被抑制時，細胞的吞噬活性顯著下降;當Ran基因過表達時，細胞的吞噬活性明顯上升。當吞噬標志性蛋白Rab5、LAMP和Ran基因表達被抑制后，無論在吞噬攝取顆粒時期還是消化處理時期，抑制Ran表達的細胞其吞噬百分率一直最低。以上結果表明，Ran蛋白參