基于小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用探討“脊髓康”神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的研究.pdf

1、脊髓損傷(Spinal cord injury, SCI)是一種嚴(yán)重致殘性疾病，其引起的殘疾無(wú)論對(duì)患者、對(duì)家庭或?qū)ι鐣?huì)都是一種最嚴(yán)重的災(zāi)難，且痛苦和負(fù)擔(dān)往往伴隨終身。目前基礎(chǔ)及臨床研究認(rèn)為，SCI后神經(jīng)元的繼發(fā)性損傷是可能被逆轉(zhuǎn)的，這為SCI治療提供了可研究方向。
　　小膠質(zhì)細(xì)胞是駐留于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)內(nèi)的免疫細(xì)胞，其為CNS的免疫與防御系統(tǒng)的重要組成部分，能夠保護(hù)CNS免受各種

2、病理因子的侵害，但其有時(shí)亦會(huì)導(dǎo)致CNS相關(guān)病變的進(jìn)一步惡化。當(dāng)中風(fēng)、腦外傷、SCI等神經(jīng)病變發(fā)生后，小膠質(zhì)細(xì)胞在對(duì)損傷局部神經(jīng)元表現(xiàn)出破壞、修復(fù)的雙重作用。一方面，小膠質(zhì)細(xì)胞可做出迅速的免疫應(yīng)答，定向遷移至病變部位后釋放大量促炎因子啟動(dòng)炎性反應(yīng)，過(guò)度的、反復(fù)的炎癥反應(yīng)及有害代謝產(chǎn)物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重的損害，導(dǎo)致大量神經(jīng)元的繼發(fā)性壞死及凋亡，影響神經(jīng)元的修復(fù)、再生;另一方面，小膠質(zhì)細(xì)胞遷移至損傷部位后，其吞噬作用可通過(guò)清除凋亡神經(jīng)元，減少

3、細(xì)胞因子、神經(jīng)毒性物質(zhì)等釋放，進(jìn)而抑制過(guò)度的免疫炎性反應(yīng)，協(xié)調(diào)、促進(jìn)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)的重建及功能的恢復(fù)。故而小膠質(zhì)細(xì)胞在CNS生理病理變化中有著重要意義。
　　“脊髓康”是筆者導(dǎo)師臨床經(jīng)驗(yàn)方，臨床實(shí)踐及研究證明該方有著良好的臨床療效?；诖朔?，我們前期系統(tǒng)開展了多項(xiàng)“脊髓康”干預(yù)SCI的基礎(chǔ)性研究，結(jié)果表明，“脊髓康”對(duì)SCI后免疫應(yīng)答有著重要的調(diào)節(jié)作用，其能有效促進(jìn)損傷神經(jīng)元的修復(fù)再生。目前，中醫(yī)藥對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的研究較少

4、，已有研究主要局限于部分中藥能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化所致的過(guò)度免疫炎性反應(yīng)以降低神經(jīng)二次損傷的方面，基于此，本研究欲從小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用角度，探討“脊髓康”有效干預(yù)SCI的潛在機(jī)制，為SCI的臨床治療提供一定科學(xué)依據(jù)。
　　本文第一部分采用慢病毒轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白基因標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2，核染色標(biāo)記死亡神經(jīng)元的方法，建立了一個(gè)可動(dòng)態(tài)觀察BV2吞噬神經(jīng)元碎片的體系，研究并證實(shí)了“脊髓康”可促進(jìn)BV2對(duì)神經(jīng)元碎片的吞噬作用;我們認(rèn)為，中

5、樞神經(jīng)系統(tǒng)是一個(gè)由多種膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元構(gòu)成的復(fù)雜體系，SCI的發(fā)生必然不是單一系統(tǒng)或某一細(xì)胞群的病變，而是多因素的“整體病變”，故在第一部分的研究基礎(chǔ)上，我們提取胎鼠的部分神經(jīng)組織，未經(jīng)特殊篩選將其接種于體外環(huán)境中培養(yǎng)，初步、簡(jiǎn)易的模擬了一個(gè)多因素、立體式、整體性的混雜細(xì)胞體系，在誘導(dǎo)混雜細(xì)胞體系中神經(jīng)元凋亡后予“脊髓康”干預(yù)，再次證實(shí)了“脊髓康”對(duì)模擬的“自然混雜體系”中小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用，體現(xiàn)了中醫(yī)藥“整體”干預(yù)的理念;上

6、述兩部分實(shí)驗(yàn)表明，“脊髓康”能有效調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬功能，那么該作用到底是否與促神經(jīng)修復(fù)有相關(guān)性？基于這些問(wèn)題，我們開展了第三部分實(shí)驗(yàn)，即驗(yàn)證“脊髓康”是否能通過(guò)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用影響神經(jīng)元修復(fù)再生，在此實(shí)驗(yàn)中，我們成功分離、提純了原代神經(jīng)元、原代小膠質(zhì)細(xì)胞，建立小膠質(zhì)細(xì)胞/損傷神經(jīng)元共培養(yǎng)體系，“脊髓康”含藥血清間接干預(yù)共培養(yǎng)體系，而后以免疫熒光雙重標(biāo)記法觀察混培養(yǎng)24h后小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元碎片的吞噬作用及96h后損傷神經(jīng)元突起

7、生長(zhǎng)情況，我們發(fā)現(xiàn)“脊髓康”促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞清理凋亡神經(jīng)元碎片的同時(shí)，存活神經(jīng)元的修復(fù)再生能力得到了明顯的提升。綜上，我們得出:中藥復(fù)方“脊髓康”能夠有效促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬神經(jīng)元碎片作用，可能以此改善局部微環(huán)境，促進(jìn)損傷神經(jīng)元的修復(fù)再生。
　　第一部分“脊髓康”對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬神經(jīng)元碎片的影響
　　目的:觀察中藥復(fù)方“脊髓康”對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬神經(jīng)元碎片的影響。
　　方法:制備“脊髓康”含藥血清，分離、培養(yǎng)、鑒定原代神經(jīng)元

8、，慢病毒轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白基因標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2，核染色標(biāo)記神經(jīng)元，熒光顯微鏡下觀察含藥血清干預(yù)后小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元碎片的吞噬作用。
　　結(jié)果:在吞噬百分率方面，“脊髓康”中、高劑量組均高于空白組(P＜0.05)，與脂多糖組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);在吞噬指數(shù)方面，“脊髓康”低、中、高劑量組均高于空白組(P＜0.05)，中、高劑量組與脂多糖組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:中藥復(fù)方“脊髓康”能

9、調(diào)控BV2對(duì)神經(jīng)元碎片的吞噬作用，其促進(jìn)損傷神經(jīng)元軸突再生的機(jī)制可能與此相關(guān)。此外，本研究為中醫(yī)藥調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞干預(yù)CNS相關(guān)疾病的研究提供了新的思路及方法。
　　第二部分“脊髓康”對(duì)自然混雜體系中原代小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的影響
　　目的:觀察中藥復(fù)方“脊髓康”對(duì)自然混雜體系中原代小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬神經(jīng)元碎片的影響。
　　方法:制備“脊髓康”含藥血清;分離、培養(yǎng)原代神經(jīng)細(xì)胞，建立混雜細(xì)胞體系并予鑒定;以谷氨酸誘導(dǎo)混雜體系中神

10、經(jīng)元損傷，以“脊髓康”含藥血清干預(yù)混雜體系;以一抗β3-tubulin、二抗Alexa594標(biāo)記神經(jīng)元骨架及碎片，以一抗CD11b、二抗Alexa488標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)膜蛋白，觀察“脊髓康”干預(yù)后混雜體系中小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元碎片的吞噬作用。
　　結(jié)果:在吞噬指數(shù)方面，“脊髓康”含藥血清低、中、高劑量組均高于空白組(P＜0.05)，中、高劑量組較LPS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);在吞噬百分率方面，中、高劑量組均高于空白組(

11、P＜0.05)，中劑量組低于LPS組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:抗SCI有效方“脊髓康”可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞清理神經(jīng)元碎片的作用，改善局部微環(huán)境，促進(jìn)損傷神經(jīng)元的修復(fù)再生。
　　第三部分“脊髓康”對(duì)共培養(yǎng)體系中小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬及損傷神經(jīng)元再生的影響
　　目的:觀察中藥復(fù)方“脊髓康”對(duì)共培養(yǎng)體系中小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬及損傷神經(jīng)元修復(fù)再生的影響。
　　方法:制備“脊髓康”含藥血清，分離、鑒定原代海馬神經(jīng)元、原代小膠質(zhì)細(xì)胞，谷氨

12、酸誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，含藥血清預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞，建立小膠質(zhì)細(xì)胞/損傷神經(jīng)元共培養(yǎng)體系，采用免疫熒光雙重標(biāo)記法觀察混培養(yǎng)24h后小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元碎片的吞噬作用及96h后損傷神經(jīng)元突起生長(zhǎng)情況。
　　結(jié)果:混培養(yǎng)24h后，“脊髓康”含藥血清中、高劑量組在吞噬指數(shù)及吞噬百分率方面均高于空白組(P＜0.05)，中劑量組低于LPS組(P＜0.05)，高劑量組則與LPS組無(wú)顯著差異(P＞0.05)?；炫囵B(yǎng)96h后，“脊髓康”含藥血清中、高劑量組

13、一級(jí)突起數(shù)量多于空白組(P＜0.05)，與LPS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)?！凹顾杩怠敝?、高劑量組平均突起較空白組長(zhǎng)(P＜0.05)，與LPS對(duì)比，“脊髓康”中劑量組平均神經(jīng)突起較短(P＜0.05)，而高劑量組則平均突起較長(zhǎng)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:“脊髓康”通過(guò)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能促進(jìn)損傷神經(jīng)元的修復(fù)與再生，這可能與其促進(jìn)凋亡物質(zhì)清理后，于局部微環(huán)境建立一個(gè)無(wú)形的保護(hù)屏障有關(guān)，但其詳細(xì)機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

14、>　　綜上所述，本研究工作的主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于:
　　1、首次從調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的角度對(duì)中醫(yī)藥干預(yù)SCI進(jìn)行了研究，為“脊髓康”溫腎通督抗SCI作用做出了新的科學(xué)闡釋。
　　2、自行研究、建立了多種能準(zhǔn)確、有效以及動(dòng)態(tài)觀察小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬神經(jīng)元碎片的方法，驗(yàn)證了“脊髓康”對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬的調(diào)控作用，一定程度上明確了該作用與神經(jīng)修復(fù)再生的相互關(guān)系。
　　3、基于中醫(yī)藥干預(yù)“整體”理念，及SCI整體病變的思考，體外建立了