CRH與Urocortin經(jīng)RhoGTPases調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞吞噬作用的機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)內(nèi)分泌與免疫功能的相互滲透作用和關(guān)聯(lián)作用,對(duì)機(jī)體在不同條件下穩(wěn)態(tài)的維持起有決定性的作用,尤其在創(chuàng)傷與感染的病理生理?xiàng)l件下。神經(jīng)內(nèi)分泌與免疫系統(tǒng)之間相互關(guān)系的研究已經(jīng)成為神經(jīng)免疫內(nèi)分泌學(xué)(Neuroimmun-endocrinology)的一個(gè)重要研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn),下丘腦分泌的神經(jīng)肽可參與外周免疫功能的調(diào)節(jié)機(jī)制,如促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotropin-releasing hormone,CRH)及其結(jié)構(gòu)相關(guān)肽uroc

2、ortin(UCN)經(jīng)過下丘腦一垂體一腎上腺(hypothalamicpituitary-adrenal,HPA)軸發(fā)揮間接地免疫/炎癥調(diào)節(jié)作用,但是外周局部的CRH與UCN可以自分泌或旁分泌的方式直接參與免疫/炎癥的調(diào)節(jié)。嚴(yán)重創(chuàng)傷或感染后機(jī)體免疫功能出現(xiàn)失調(diào),尤其是巨噬細(xì)胞免疫功能改變可導(dǎo)致機(jī)體防御感染的免疫功能紊亂,導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)、

3、多器官功能衰竭(multiple organfailure,MOF)的易感性增加。巨噬細(xì)胞功能紊亂的機(jī)制很復(fù)雜,可能與微環(huán)境中神經(jīng)內(nèi)分泌激素等有關(guān)。因此,深入探討神經(jīng)肽CRH與UCN對(duì)細(xì)胞免疫功能影響及機(jī)制有利于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),豐富創(chuàng)傷或感染后免疫功能紊亂的免疫平衡調(diào)控策略。
　　 CRH與UCN,以及它們的受體在機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周組織與器官分布非常廣泛。CRH與UCN通過與其受體結(jié)合,激活多種G蛋白,從而可能激活下游

4、多種信號(hào)通路,發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。目前關(guān)于CRH在調(diào)節(jié)機(jī)體行為、內(nèi)分泌、自律性以及應(yīng)激免疫等方面的研究已積累了很多資料。越來越多的證據(jù)表明外周CRH與UCN在調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)過程發(fā)揮著重要的作用。吞噬清除作用作為巨噬細(xì)胞重要的天然免疫功能,在機(jī)體嚴(yán)重創(chuàng)傷后感染后往往受到抑制。盡管對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬機(jī)制已有廣泛的認(rèn)識(shí),但是關(guān)于CRH與UCN,在巨噬細(xì)胞天然吞噬功能中的調(diào)節(jié)作用,目前知之甚少。
　　 本研究通過采用原代培養(yǎng)大鼠腹腔巨噬

5、細(xì)胞,觀察CRH與UCN對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球的吞噬率以及平均熒光強(qiáng)度的影響、及其對(duì)巨噬細(xì)胞在吞噬過程中細(xì)胞骨架蛋白重塑與解聚的動(dòng)態(tài)影響,明確CRH與UCN對(duì)巨噬細(xì)胞天然吞噬功能的調(diào)節(jié)作用。接著深入研究CRH與UCN調(diào)控巨噬細(xì)胞骨架蛋白調(diào)節(jié)因子。Rho GTPases亞家族蛋白R(shí)hoA、Rac1磷酸化的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系,進(jìn)而利用信號(hào)分子阻斷策略探討CRH與UCN調(diào)控巨噬細(xì)胞RhoA、Rac1磷酸化的受體途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,旨在揭示CR

6、H與UCN調(diào)控巨噬細(xì)胞天然吞噬功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果:
　　 1.通過流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)合熒光微球分析了CRH與UCN對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示CRH在10-8M水平可顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬微球功能。UCN在10-10～10-7濃度均能夠明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能。
　　 2.正常巨噬細(xì)胞的骨架蛋白均勻分布在胞核與胞漿,在胞膜周邊有輕度的集中。在CRH孵育細(xì)胞1h后,F-actin骨架

7、蛋白向細(xì)胞周邊聚集,膜上出現(xiàn)單層絲狀偽足。UCN刺激后F-actin改變與CRH刺激后相似,吞噬30min時(shí)骨架蛋白重塑更明顯,60min時(shí)骨架蛋白表達(dá)量卻下降。這種動(dòng)態(tài)變化現(xiàn)象與CRH與UCN刺激后巨噬細(xì)胞吞噬改變相一致。
　　 3.CRH以10-8M濃度孵育巨噬細(xì)胞30min后Rac1磷酸化水平明顯增加,60min后RhoA磷酸化水平達(dá)到峰值。UCN在10-10～10-7M濃度孵育細(xì)胞時(shí)均可顯著增強(qiáng)RhoA、Rac1磷酸化水

8、平。其中10-8M的UCN孵育細(xì)胞30min后Rac1磷酸化水平增加最明顯,但是RhoA磷酸化水平呈現(xiàn)雙峰狀增加,持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。
　　 4.Rho-ROCK的特異性抑制劑W56、選擇性Rac1抑制劑Y27632預(yù)孵育細(xì)胞后,可明顯抑制CRH、UCN對(duì)巨噬細(xì)胞的促吞噬作用。Y27632、W56預(yù)孵育后細(xì)胞周邊絲狀偽足量少,周邊聚集不明顯,絲狀、板狀偽足伸展變短,可阻礙F-actin重塑。
　　 5.CRHR1的特異性拮抗劑

9、Antalarmin、CRHR1/R2非特異性拮抗劑Astressin預(yù)處理后,CRH與UCN孵育細(xì)胞對(duì)熒光微球的吞噬率明顯下降。在Antalarmin預(yù)孵育后,CRH所致的RhoA磷酸化可被完全抑制,而對(duì)由CRH所致的Rac1磷酸化抑制的程度與Astressin預(yù)孵育后的效應(yīng)接近。Antalarmin預(yù)孵育后,對(duì)由UCN所致的RhoA磷酸化水平?jīng)]有影響,Rac1磷酸化水平輕微降低,但是在Astressin預(yù)孵育后,UCN孵育所致的Rh

10、oA、Rac1磷酸化水平均明顯降低。
　　 6.CRH與UCN孵育靜息狀態(tài)下的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞,PKA活性增強(qiáng)非常顯著。PKA活性在CRH作用后15min達(dá)到高峰,而在UCN作用后的10min至60min呈逐漸增加趨勢(shì)。PKC活性在CRH與UCN孵育細(xì)胞后增加比較迅速,在15min時(shí)到達(dá)高峰。MDL-12330A預(yù)孵育細(xì)胞阻斷PKA后,CRH、UCN對(duì)細(xì)胞RhoA磷酸化的影響均顯著下降。在應(yīng)用CR預(yù)孵育細(xì)胞后CRH對(duì)RhoA磷酸

11、化增強(qiáng),對(duì)Rac1磷酸化水平?jīng)]有明顯影響。但是CR預(yù)孵育細(xì)胞后UCN對(duì)RhoA磷酸化影響下降約63％,對(duì)Rac1磷酸化影響顯著下降。
　　 7.CRH以10-8M的濃度刺激巨噬細(xì)胞后ERK1/2磷酸化增強(qiáng),5min時(shí)最顯著,持續(xù)到15min。UCN孵育巨噬細(xì)胞后ERK1/2磷酸化水平5-30min持續(xù)高水平。在PD98059預(yù)處理后可完全抑制CRH對(duì)RhoA的表達(dá)升高作用,預(yù)處理后UCN對(duì)RhoA磷酸化升高完全被逆轉(zhuǎn),對(duì)Rac1

12、的表達(dá)影響的抑制率達(dá)47.7％
　　 結(jié)論
　　 1.CRH與UCN可明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能,UCN的促吞噬作用強(qiáng)于CRH。CRH對(duì)吞噬作用的影響具有濃度依賴性,其中在10-8M濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞吞噬效應(yīng)最強(qiáng);UCN在10-10～10-7濃度時(shí)均能夠明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能。
　　 2.CRH與UCN可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞骨架蛋白重塑,這與CRH與UCN增強(qiáng)吞噬作用相一致。表現(xiàn)為CRH與UCN孵育后的巨噬細(xì)胞F-actin

13、骨架蛋白向細(xì)胞周邊聚集,膜上出現(xiàn)粘附斑以及偽足增加,尤其UCN刺激后細(xì)胞出現(xiàn)板狀偽足延伸。
　　 3.Rho GTPases在CRH與UCN調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞天然吞噬免疫中起到重要作用。CRH與UCN可通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞Rho GTPases中的RhoA、Rac1磷酸化水平,以促進(jìn)巨噬細(xì)胞骨架蛋白的重塑,從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。
　　 4.CRH與UCN通過不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,最后由Rho特異性的通路調(diào)節(jié)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞骨架

14、蛋白重塑。CRH通過與CRHR1結(jié)合,激活cAMP-PKA/ERK1/2信號(hào)通路,促進(jìn)RhoA、Rac1磷酸化;UCN主要與CRHR2結(jié)合,通過PKC/ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)RhoA、Rac1磷酸化。
　　 5.CRH與UCN是結(jié)構(gòu)相關(guān)肽,對(duì)巨噬細(xì)胞天然吞噬功能的作用相似,但是信號(hào)通路不同。這種差異性反映了它們?cè)谡{(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞吞噬過程中對(duì)吞噬活性以及細(xì)胞骨架蛋白重塑的影響有所不同。這些肽可能決定了微環(huán)境中由外源性刺激引發(fā)的細(xì)胞吞