靶向CX3CL1的RNA干擾在病毒性肝炎及癌癥中的治療作用.pdf

1、在1999年9月份，當(dāng)一個(gè)正在通過肝動(dòng)脈給藥，接受高滴度腺病毒載體治療的病人死于病毒載體所引發(fā)的毒性反應(yīng)后，人們對于腺病毒(Ad)載體用于臨床基因治療的理解發(fā)生了轉(zhuǎn)變。當(dāng)然，在臨床治療中所需的對腺病毒載體的連續(xù)性給藥可能關(guān)系到機(jī)體對腺病毒的強(qiáng)烈反應(yīng)，但是更重要的是，通過研究人們獲得了更多的對腺病毒毒性的了解。我們都意識(shí)到，沒有哪一種載體系統(tǒng)是完美無缺的。在看到腺病毒載體并不適于所有治療應(yīng)用的同時(shí)，我們也不會(huì)因此而忽略腺病毒載體那些相對于

2、其他載體系統(tǒng)的顯著優(yōu)點(diǎn)：能夠有效地感染靜息或分裂中細(xì)胞，這是很多載體無法做到的；腺病毒能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高水平的基因表達(dá)，這對于那些只需要短期高表達(dá)轉(zhuǎn)基因就能產(chǎn)生足夠治療效應(yīng)的應(yīng)用意義重大。腺病毒載體潛在應(yīng)用包括治療性的血管生成作用，能夠在中央神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)實(shí)施感染，以及在那些腺病毒的毒副作用也能產(chǎn)生幫助的治療當(dāng)中如作為腫瘤疫苗。當(dāng)然毫無疑問的是，為了更廣泛地應(yīng)用腺病毒載體，解決其引起體內(nèi)免疫應(yīng)答的問題是當(dāng)務(wù)之急。本次研究集中在腺病

3、毒誘導(dǎo)的肝臟損傷，誘導(dǎo)體內(nèi)肝臟抗病毒免疫抑制和黑色素瘤基因治療方面，獲得了如下的結(jié)果： 1、新型高壓注射重組腺病毒誘導(dǎo)肝損傷模型的建立目前，腺病毒載體能在肝臟中定位并引起肝臟炎癥和損傷的研究甚多，但是通用的動(dòng)物模型研究并不多。本部分研究的目的就是建立一種新的腺病毒誘導(dǎo)的爆發(fā)性肝炎模型，來促進(jìn)對腺病毒誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎的機(jī)制研究。我們采用了高壓注射(注射體積占體重10％，并在7秒中內(nèi)完成注射)腺病毒載體的方法，將腺病毒載體快速地

4、特異地通過尾靜脈傳遞到小鼠肝臟內(nèi)部，觀察后繼的病毒感染引起的肝臟損傷。C57 BL/6小鼠尾靜脈高壓注射表達(dá)不同產(chǎn)物的腺病毒(AdLacZ，AdEGFP，AdsiNeg)，通過流式細(xì)胞術(shù)分析肝臟內(nèi)部淋巴細(xì)胞的比例和絕對數(shù)，血清轉(zhuǎn)氨酶和H&E染色被用作評價(jià)肝臟損傷的指標(biāo)。我們發(fā)現(xiàn)，高壓注射腺病毒比普通注射誘導(dǎo)更加嚴(yán)重的肝臟炎癥：大量的單個(gè)核細(xì)胞迅速浸潤，尤其是肝臟NK細(xì)胞顯著增加和活化；同時(shí)發(fā)現(xiàn)血清ALT轉(zhuǎn)氨酶水平大幅升高；肝臟內(nèi)出現(xiàn)多處

5、壞死：IFN-γ在肝臟中的轉(zhuǎn)錄水平及在血清中蛋白水平上升。通過注射抗體預(yù)先清除NK細(xì)胞，可以顯著減輕腺病毒誘導(dǎo)的肝臟損傷以及炎癥因子IFN-γ的表達(dá)水平。這些數(shù)據(jù)表明腺病毒感染誘導(dǎo)了肝臟中NK細(xì)胞的浸潤和活化，從而導(dǎo)致了肝細(xì)胞的損傷以及肝臟炎癥的產(chǎn)生，NK細(xì)胞是該模型中病毒感染引發(fā)的早期炎癥的主要效應(yīng)細(xì)胞?？偟膩碚f，我們的工作展示了一個(gè)與人的急性肝臟感染相關(guān)的新的病毒肝炎模型，為研究腺病毒提供了一個(gè)實(shí)用有效的工具和平臺(tái)。 2、治療性RN

6、A干擾CX3CL1抑制腺病毒引起的肝臟損傷我們研究了趨化因子CX3CL1/fractalkine(FKN)在抗病毒感染免疫應(yīng)答中的作用。FKN是一種CX3C類的趨化因子，有膜結(jié)合型和分泌型兩種存在形式。大部分NK細(xì)胞，CD14<'+>單核細(xì)胞及部分的CD8<'+>T細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)受體CX3CR1。通過進(jìn)一步研究以上構(gòu)建的高壓注射腺病毒誘導(dǎo)的肝臟損傷模型，我們發(fā)現(xiàn)CX3CL1在腺病毒感染的肝臟中是顯著上調(diào)的，并且有意思的是同時(shí)發(fā)現(xiàn)浸潤到炎癥

7、肝臟中的主要效應(yīng)細(xì)胞NK細(xì)胞上相應(yīng)受體的CX3CR1表達(dá)也顯著上調(diào)。為了進(jìn)一步證明二者關(guān)系，我們構(gòu)建了表達(dá)重組小鼠CX3CL1的腺病毒進(jìn)行注射，發(fā)現(xiàn)在肝臟內(nèi)過表達(dá)CX3CL1大大增加了CX3CR1<'+>NK細(xì)胞的浸潤和活化水平，血清中ALT轉(zhuǎn)氨酶的水平及肝臟壞死程度也大幅升高。這表明腺病毒感染肝臟后誘導(dǎo)肝臟內(nèi)CX3CL1的表達(dá)增加，CX3CL1與其受體CX3CR1相互作用在NK細(xì)胞的招募和活化以及IFN-γ的產(chǎn)生中行使重要的作用。因此

8、，抑制CX3CL1的表達(dá)將可作為抗腺病毒炎癥治療的一個(gè)選擇。實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用高壓注射表達(dá)CX3CL1特異性干擾小RNA的腺病毒進(jìn)行了體內(nèi)RNA干擾，發(fā)現(xiàn)病毒感染后CX3CL1在肝臟中的表達(dá)水平被明顯抑制，相應(yīng)地，NK細(xì)胞的浸潤及肝臟損傷和炎癥也顯著下調(diào)。為了更好地驗(yàn)證CX3CL1的促炎癥作用，我們在注射腺病毒之前用CX3CL1或CX3CR1的阻斷抗體預(yù)先處理小鼠，結(jié)果顯示肝臟中的炎癥損傷及淋巴細(xì)胞浸潤也能被很好地抑制。綜上，該實(shí)驗(yàn)證明了CX

9、3CL1-CX3CR1趨化因子系統(tǒng)在腺病毒誘導(dǎo)的肝臟損傷中的促炎癥功能和重要性，并為體內(nèi)基因治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)和手段。 3、RNA干擾CX3CL1抑制黑色素瘤體內(nèi)生長及機(jī)制研究雖然有報(bào)道稱過表達(dá)的CX3CL1促進(jìn)對腫瘤細(xì)胞的殺傷，CX3CL1行使的是抑制腫瘤生長的作用。而我們的研究經(jīng)RT-PCR，Western Blotting以及免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)小鼠黑色素瘤B16-F0細(xì)胞及一些腫瘤病人的實(shí)體瘤表達(dá)CX3CL1。

10、進(jìn)一步的流式細(xì)胞術(shù)抗體檢測發(fā)現(xiàn)B16上CX3CL1為陽性，而ELISA檢測發(fā)現(xiàn)B16的培養(yǎng)上清中無可溶性FKN的表達(dá)，這證明了B16表達(dá)的CX3CL1為膜結(jié)合型。因此我們猜測這種膜結(jié)合型的CX3CL1可能參與了腫瘤的發(fā)生過程。運(yùn)用表達(dá)CX3CL1特異性干擾小RNA的腺病毒感染B16-F0黑色素瘤細(xì)胞，沉默了B16細(xì)胞上CX3CL1的表達(dá)。通過流式細(xì)胞分選技術(shù)篩選得到CX3CL1表達(dá)被有效抑制的B16細(xì)胞。在C57 BL/6小鼠上進(jìn)行體內(nèi)

11、荷瘤的結(jié)果發(fā)現(xiàn)CX3CL1敲除鼠與對照組相比腫瘤的成瘤性大幅降低：生存曲線數(shù)據(jù)表明CX3CL1敲除組的小鼠的生存情況要顯著優(yōu)于對照組。對腫瘤切片加以研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)CX3CL1的受體CX3CR1；CX3CL1敲除組的腫瘤生長受到嚴(yán)重抑制且瘤體內(nèi)部和周圍只有少量的血管生成，而對照組腫瘤生長旺盛，并伴隨著大量的腫瘤內(nèi)血管分布。因此我們有理由認(rèn)為腫瘤表達(dá)一定水平的CX3CL1來促進(jìn)它們自身與體內(nèi)表達(dá)CX3CR1的血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用