鋅指蛋白Zfx在人腦膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞自我更新和抗凋亡機(jī)制研究.pdf

1、第一部分鋅指蛋白Zfx在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與意義
　　 目的:X 染色體耦聯(lián)鋅指蛋白（Zfx）是鋅指蛋白超家族中的一員，是胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞自我更新的共同分子基礎(chǔ)，Zfx在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和惡性程度的關(guān)系有待探討。
　　 方法:收集52例經(jīng)病理證實(shí)的人腦膠質(zhì)瘤腫瘤標(biāo)本和8例正常腦組織標(biāo)本，根據(jù)病理結(jié)果對(duì)人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行分組，通過實(shí)時(shí)定量PCR、免疫組織化學(xué)和免疫蛋白印跡等方法對(duì)標(biāo)本中Zfx的

2、mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)正常腦組織和不同惡性程度人腦膠質(zhì)瘤中Zfx的表達(dá)進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果:免疫組化染色結(jié)果顯示，Zfx 主要表達(dá)于細(xì)胞核。人腦膠質(zhì)瘤中Zfx的mRNA和蛋白表達(dá)表達(dá)均高于其在正常腦組織中的表達(dá)，在不同病理分級(jí)的腦膠質(zhì)瘤中Zfx的表達(dá)水平有差異，Zfx的表達(dá)水平隨腦膠質(zhì)瘤的惡性程度增高而增高。
　　 結(jié)論:Zfx的mRNA和蛋白表達(dá)在人腦膠質(zhì)瘤中異常增高，與人腦膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正

3、相關(guān)，它有可能是腦膠質(zhì)瘤抗凋亡、惡性增殖的一個(gè)關(guān)鍵性的調(diào)控因子。
　　 第二部分鋅指蛋白Zfx在人腦腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)與意義
　　 目的:X 染色體耦聯(lián)鋅指蛋白（Zfx）是鋅指蛋白超家族中的一員，是胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞自我更新的共同分子基礎(chǔ)，Zfx在人腦腫瘤干細(xì)胞(BTSCs)中的表達(dá)有待探討。
　　 方法:從人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87中分選和鑒定腦腫瘤干細(xì)胞，通過免疫蛋白印跡法對(duì)樣本中Zfx的表達(dá)進(jìn)行檢

4、測，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)人腦腫瘤干細(xì)胞中Zfx的表達(dá)進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果:CD133 陽性細(xì)胞在人腦膠質(zhì)瘤中所占比例極其微?。篣251 約1.97％±0.53％，U87 約1.32％±0.34％。CD133 陽性細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中可以形成腫瘤球，且神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物nestin 染色陽性；未分化腫瘤球在完全培養(yǎng)基中分化為腫瘤細(xì)胞，并表達(dá)與來源膠質(zhì)瘤細(xì)胞相似的神經(jīng)元標(biāo)志物β-tubulin和星形細(xì)胞標(biāo)志物神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GF

5、AP）。未分化腫瘤球中Zfx的蛋白表達(dá)水平明顯高于其在分化腫瘤球和來源膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 結(jié)論:Zfx的蛋白表達(dá)在人腦腫瘤干細(xì)胞中異常增高，它有可能是腦腫瘤干細(xì)胞自我更新、抗凋亡的一個(gè)關(guān)鍵性的調(diào)控因子。
　　 第三部分 Zfx基因慢病毒RNA干擾載體構(gòu)建及有效靶點(diǎn)篩選
　　 目的：構(gòu)建人Zfx基因慢病毒RNA 干擾載體，篩選干擾效率最高的有效靶點(diǎn)。
　　 方法：根據(jù)Zfx基因（NM_003410）

6、序列，利用軟件設(shè)計(jì)合成Zfx基因的特異性短發(fā)夾環(huán)（shRNA）干擾片段，將干擾片段構(gòu)建到pFU-GW-iRNA 慢病毒載體中，獲得Zfx的慢病毒RNA 干擾載體。將慢病毒RNA 干擾載體轉(zhuǎn)染到人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251中，轉(zhuǎn)染7天后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR和免疫蛋白印跡法檢測干擾效率。
　　 結(jié)果：病毒轉(zhuǎn)染效率由熒光顯微鏡下GFP 陽性表達(dá)細(xì)胞在細(xì)胞總數(shù)中所占比例表示。轉(zhuǎn)染7天后熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)m

7、ock和 Zfx-RNAi組的病毒轉(zhuǎn)染效率均大于90％。干擾效率則由實(shí)時(shí)定量PCR和免疫蛋白印跡法檢測，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染7天后Zfx-RNAi 各組中R2組的干擾效率最高，免疫蛋白印跡法證實(shí)轉(zhuǎn)染14天后R2組中Zfx 蛋白表達(dá)明顯低于control和mock組。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建人Zfx基因慢病毒RNA 干擾載體并篩選出干擾效率最高的有效靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研究Zfx在人腦膠質(zhì)瘤中的作用提供可靠的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)和研究基礎(chǔ)。

8、r>　　 第四部分鋅指蛋白Zfx在腦腫瘤干細(xì)胞自我更新和抗凋亡機(jī)制研究
　　 目的：X 染色體耦聯(lián)鋅指蛋白（Zfx）是鋅指蛋白超家族中的一員，是胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞自我更新的共同分子基礎(chǔ)，Zfx在人腦膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞中作用機(jī)制有待探討。
　　 方法：在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87中通過慢病毒RNA 干擾介導(dǎo)Zfx沉默，免疫磁珠法分選和鑒定腦腫瘤干細(xì)胞，通過克隆形成、凋亡流式檢測和免疫蛋白印跡等方法探索Zfx在人腦膠質(zhì)