人附睪蛋白質(zhì)組的研究及附睪頭、體、尾間蛋白表達差異分析.pdf

1、附睪是連接睪丸和輸精管的高度卷曲的管道，主要由附睪管組成，大體分為頭、體、尾三部分。睪丸中形成的精子已完成數(shù)量上的增加、特性上的分化、遺傳物質(zhì)的再分配以及結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化，但尚缺乏自主的前向運動能力和受精能力。進入附睪中的精子，DNA已經(jīng)濃縮，不再具有或很少有轉(zhuǎn)錄活性，其運動能力和受精能力的獲得認為完全是在附睪提供的微環(huán)境中進行的。由于附睪各部分上皮細胞的特異性分泌和選擇性重吸收，使得附睪液中的成分處于連續(xù)動態(tài)變化中。精子在附睪運行過程中

2、與附睪液相互作用，被認為與精子逐步成熟密切相關(guān)。 蛋白質(zhì)組學技術(shù)為研究附睪蛋白提供了有效手段。目前，許多學者對馬、豬、大鼠等附睪管腔液中的蛋白及附睪分泌蛋白進行了研究；而對附睪組織本身蛋白表達情況研究較少。 目的：為了從蛋白質(zhì)水平研究附睪的生理機能，我們應用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)展示人附睪組織的蛋白質(zhì)表達情況，并且差異分析人附睪頭、體、尾之間特異表達的蛋白。 方法：液氮研磨附睪組織，利用蛋白提取裂解液分別提取人附

3、睪總蛋白以及附睪頭、體、尾的蛋白，Bradford法測定蛋白濃度；然后利用雙向凝膠電泳(2-DE)分別分離樣品蛋白：第一向采用固相pH梯度(pH3～10)膠條等電聚焦，第二向采用12﹪SDS-PAGE分離，上樣量分別為80ug(用于銀染)和500ug(用于考染);電泳結(jié)束后，通過ImageScanner掃描儀進行圖像掃描，采用ImageMaster2D-Elite3.01圖像分析軟件對采集圖像進行圖像分析，包括斑點檢測、附睪頭、體、尾的

4、圖譜的差異分析；利用MALDI-TOFMS，采用肽質(zhì)量指紋譜(PMF)的方法鑒定2D凝膠上的蛋白；對鑒定結(jié)果進行生物信息學分析。 結(jié)果：(1)應用雙向電泳技術(shù)，獲得了染色背景較好、分辨率較高的人附睪總蛋白的電泳圖譜；經(jīng)軟件分析，分別從銀染、考染的凝膠圖譜上識別到1878和1362個蛋白點，膠上的點主要分布在pI4～8、Mr10～75kDa的區(qū)域；利用質(zhì)譜，鑒定出427種附睪表達的蛋白，它們代表了膠上700多個點。 (2)

5、利用生物信息學，對這些蛋白的分子量、等電點、亞細胞定位、功能分析顯示：分子量分布在10～70kDa之間的蛋白占90.2﹪，Mr＜10kDa和Mr＞100kDa的蛋白分別占2.3﹪和2.6﹪；pI＜9和pI＞9的蛋白分別占94.6﹪和5.4﹪；這些蛋白大部分定位在細胞質(zhì)、線粒體和細胞核中，而定位細胞膜上的蛋白質(zhì)只有4種(1.4﹪)；蛋白功能分類中，酶成分最多，占38.5﹪(143種)，其次是細胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白(14.8﹪)、結(jié)合/載體蛋白(

6、11.6﹪)、信號分子(9.7﹪)、合成代謝目關(guān)蛋白(8.1﹪)和分子伴侶/熱休克蛋白(5.9﹪)等。 (3)獲得了較高質(zhì)量的人附睪頭、體、尾組織蛋白的雙向電泳圖譜(考染)，經(jīng)軟件分析，共有72個點在附睪頭、體、尾之間有顯著差異;質(zhì)譜鑒定出31種蛋白代表了圖譜上38個差異的點。按功能大體分成了參與基礎(chǔ)代謝類、參與氨基酸代謝類、抗氧化作用類和參與平滑肌組織構(gòu)成等五類。大部分差異蛋白表達的部位與該段附睪預期的功能相一致。 結(jié)

7、論：(1)我們首次利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)，對人附睪組織的蛋白表達情況進行了研究。利用雙向電泳，得到了高質(zhì)量的電泳圖譜；利用MALDI-TOF質(zhì)譜儀，鑒定出427種附睪表達蛋白。這為深入研究附睪功能提供了重要的線索。 (2)結(jié)果分析顯示，雙向電泳對大分子量蛋白、極酸或極堿蛋白、高疏水性蛋白(膜蛋白)的分離效果較差，但仍然是目前用于蛋白質(zhì)組學研究最有效的分離手段。 (3)差異蛋白質(zhì)組學研究方法有助于闡明附睪各部分的生理功能，這些