骨肉瘤患者組織標(biāo)本間的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：骨肉瘤是原發(fā)于骨髓的高度惡性腫瘤，是一種間葉組織來源的惡性腫瘤，其特征是增殖的腫瘤細(xì)胞直接形成骨或骨樣組織。骨肉瘤好發(fā)于10～20歲的青少年，目前局部發(fā)病未發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者接受手術(shù)治療及新輔助化療后5年生存率可達(dá)到60％-70%。然而其病程短且進(jìn)展快，早期即可出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，最常經(jīng)血行轉(zhuǎn)移至肺。因大多數(shù)骨肉瘤患者癥狀隱匿，有些患者初診較晚，就診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，這類患者即使接受新輔助化療，其對(duì)化療藥物會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，其5年生存率

2、只有20-40%左右，預(yù)后較差。比較蛋白質(zhì)組學(xué)探索不同時(shí)期、不同組織、不同狀態(tài)或不同外界條件作用下細(xì)胞或生物體的蛋白質(zhì)表達(dá)變化的相關(guān)信息，可以明確重要生理及病理體系差異蛋白質(zhì)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其異常的原因。其技術(shù)的發(fā)展使得高通量篩選不同類型的腫瘤或正常組織的差異蛋白質(zhì)成為可能，差異表達(dá)蛋白質(zhì)的分析鑒定為腫瘤分子標(biāo)記物及新藥物治療分子靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)，為我們更有利于了解生命活動(dòng)規(guī)律提供了幫助。本課題比較早期發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤與早期沒有發(fā)生肺

3、轉(zhuǎn)移的骨肉瘤間的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，在蛋白質(zhì)水平探查骨肉瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥及轉(zhuǎn)移機(jī)制，為骨肉瘤的早期診斷、預(yù)后判斷和個(gè)性化治療等提供依據(jù)。
　　方法：收集2014年1月至2016年1月河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科確診并通過手術(shù)切除的骨肉瘤標(biāo)本6例，其中分為發(fā)病1年內(nèi)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的3例（Ⅰ組）和發(fā)病1年內(nèi)沒有發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的3例（Ⅱ組），利用TCA-丙酮沉淀法分別對(duì)收集的Ⅰ組和Ⅱ組樣品提取總蛋白，各組混合后再由胰酶對(duì)各組總蛋白質(zhì)進(jìn)行消化

4、為多肽。以不同iTRAQ試劑盒對(duì)各組總蛋白消化得到的肽段分別進(jìn)行標(biāo)記，將混合肽段用強(qiáng)陽離子交換柱和C18反向柱進(jìn)行分級(jí)分離，采用液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜檢測技術(shù)進(jìn)行鑒定，數(shù)據(jù)結(jié)果經(jīng)Mascot檢索軟件在Uniprot_human數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，得到兩組樣本的總蛋白譜和差異蛋白相對(duì)定量定性結(jié)果。我們對(duì)所得數(shù)據(jù)以閾值（差異倍數(shù)大于1.5，p值小于0.05）進(jìn)行篩選，對(duì)鑒定得的蛋白質(zhì)進(jìn)行pathway生物信息分析，得到相應(yīng)的生物信息通路信息。
　

5、　結(jié)果：根據(jù)篩選條件，我們通過Proteome Discoverer1.3軟件共找到兩組間差異表達(dá)蛋白202個(gè)，KEGG信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)了這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)涉及許多癌癥相關(guān)的生物信息通路，如：病毒致癌、惡性腫瘤中蛋白聚糖、惡性腫瘤中小分子核糖核酸、癌癥生物路徑等，此外這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)還涉及與細(xì)胞及蛋白遷移的相關(guān)生物信息通路，如：白細(xì)胞游出遷移、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、粘著斑、緊密連接等。其中在這些信號(hào)通路中重復(fù)率較高的6個(gè)相關(guān)

6、差異表達(dá)蛋白是：α輔肌動(dòng)蛋白-1、α輔肌動(dòng)蛋白-4、肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈-9、肌糖蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白α4。其中早期發(fā)生肺轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者標(biāo)本中表達(dá)上調(diào)的蛋白有肌糖蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白α4；早期沒有發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者標(biāo)本中表達(dá)上調(diào)的蛋白有α輔肌動(dòng)蛋白-1、α輔肌動(dòng)蛋白-4和肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈-9。
　　結(jié)論：
　　1以早期有無發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者標(biāo)本作為研究對(duì)象，首次采用iTARQ結(jié)合LC-MS/MS的方法篩選出了

7、骨肉瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達(dá)蛋白共202個(gè)，KEGG信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫分析顯示了差異蛋白質(zhì)涉及的信號(hào)通路，為研究骨肉瘤的浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了線索。
　　2發(fā)現(xiàn)α輔肌動(dòng)蛋白1（ACTN1）、α輔肌動(dòng)蛋白4（ACTN4）、肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈9（MYL9）在早期沒有發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者標(biāo)本中高表達(dá)；而肌糖蛋白（TNC）、纖連蛋白（FN）、層粘連蛋白α4鏈（LAMA4）在早期發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者標(biāo)本中高表達(dá)；說明這幾種蛋白可能與骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)