巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、粘附的機(jī)理研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是動(dòng)脈血管壁受損后的慢性炎癥性疾病，盡管采取了積極的血管干預(yù)、控制血壓以及調(diào)脂等治療手段，目前仍是發(fā)病和死亡的主要原因。本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)特異性沉默MIF蛋白的表達(dá)并觀察MIF對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、粘附中所起的作用并探討其作用機(jī)制。 第一部分、siRNA靶向MIF重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選。 目的：構(gòu)建并鑒定MIF特異性siRNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將其導(dǎo)入phoenix細(xì)胞中，篩

2、選出分泌MIF-siRNA病毒的包裝細(xì)胞，進(jìn)而鑒定該病毒上清可抑制MIF蛋白的表達(dá)。 方法： 1. pSuper．retroRNAi的設(shè)計(jì)及合成。 根據(jù)GenBank提供的MIF基因cDNA序列，所選擇MIF的靶點(diǎn)序列分別為： pSRP/MIF-siRNA1 5'-CTATTACGACATGAACGCG-3' pSRP/MIF-siRNA2 5'-CAACTCCACCTTCGCCT

3、AA-3 2. 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建。 將合成的正、反義鏈經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性后形成雙鏈MIF基因siRNA，采用雙鏈定向亞克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SUPER．retro，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株E．coli DH5α，氨芐青霉素（100mg/L）篩選出陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒。 3. 重組質(zhì)粒MIFsiRNA的鑒定。 重組質(zhì)粒用EcoRⅠ與HindⅢ酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳。陽(yáng)性克隆分別命名為pSRP/MIF

4、1、pSRP/MIF2，純化后測(cè)序鑒定。 4. 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝病毒細(xì)胞株。 將包裝病毒細(xì)胞phoenix接種到6孔板中，分別使用pSRP、pSRP/MIF1、pSRP/MIF2質(zhì)粒各4μg，脂質(zhì)體Lipofectamin200010μl/孔轉(zhuǎn)染phoenix。轉(zhuǎn)染后嘌呤霉素篩選3-4周獲得陽(yáng)性克隆。細(xì)胞株命名為phoenix-pSRP、phoenix-pSRP/MIF1 siRNA、phoenix-pSRP/MIF2

5、siRNA。 5. 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HeLa細(xì)胞株。 將篩選獲得的phoenix陽(yáng)性克隆培養(yǎng)至90%融合后換成無(wú)嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，24小時(shí)后收集細(xì)胞上清，濾液-70℃保存。HeLa細(xì)胞株接種到6孔板中，加入1ml phoenix細(xì)胞上清濾液并加入2μg/ml的聚凝胺，更換含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，約20天篩選完成。所產(chǎn)生的細(xì)胞株分別命名為HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF1 siRNA、HeLa-

6、pSRP/MIF2 siRNA。 6. Western-blot檢測(cè)MIF蛋白的沉默。 將篩選后的HeLa細(xì)胞株接種到6孔板中，培養(yǎng)生長(zhǎng)至90%時(shí)，收集細(xì)胞。用細(xì)胞裂解液裂解，15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TTBS 37℃封閉1-2h，分別加入兔抗人MIF多克隆抗體（1：1000稀釋），或小鼠抗人GAPDH單克隆抗體（1：1000稀釋）4℃孵育過(guò)夜。TTBS漂洗5minx3次

7、；兔抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（1：5000稀釋）37℃孵育1h； TTBS漂洗5 min×3次；SuperSignal Weste Femto敏感曝光試劑盒曝光底片顯影。 第二部分、MIF在細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、粘附中的作用研究。 目的：探討MIF對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、粘附功能的影響和機(jī)制。 方法： 1. 細(xì)胞培養(yǎng)。 將HeLa-pSRP和HeLa-pSRP/MIF用含1μg/ml嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基37℃

8、5%CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%左右更換為完全培養(yǎng)基。將細(xì)胞消化至12孔板，起始細(xì)胞數(shù)為0．1×106/孔，連續(xù)計(jì)數(shù)6天。 2. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF細(xì)胞周期及凋亡。 用Profile Ⅱ型流式細(xì)胞儀，在488nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定細(xì)胞DNA，用Multicycle軟件分析細(xì)胞周期分布情況。 3. 細(xì)胞衰老試驗(yàn)。 HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF消化

9、后將1×105 HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF細(xì)胞懸液分別進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。0．2%戊二醛固定5分鐘后，加入X-gal混合液2ml/孔，放入溫箱孵12小時(shí)，鏡檢，陽(yáng)性細(xì)胞為出現(xiàn)藍(lán)綠色。 4. 免疫熒光檢測(cè)。 將HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF細(xì)胞分別消化成細(xì)胞懸液加已加蓋玻片的6cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%后，去除培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛溶液固

10、定20分鐘，后使用0．1%Triton X-100-PBS浸泡10分鐘PBS/0．1%Triton X-100滲透10min，PBS洗滌3次，每次5min； 5%BSA封閉30min后加一抗：p53抗體（1：100稀釋）4℃孵育過(guò)夜。PBS清洗3次，每次5分鐘，5%BSA再封閉30 min；加二抗：加入Alexa Fluor 555 rabbit anti-mouse IgG（H+L）（1：1000稀釋）Molecular Probe公

11、司，室溫孵育45分鐘。PBS洗滌5次，每次5min（避光），加入DAPI（1：1000稀釋）室溫染核10分鐘。PBS清洗1次，（避光）封片，在載玻片上滴一滴水溶性封片劑，然后將蓋玻片（培養(yǎng)有細(xì)胞的一面朝向水溶性封片劑）從一側(cè)輕輕粘在載玻片上，激光共聚焦顯微鏡掃描和照相。 5. 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。 在Transwell下室的DMEM培養(yǎng)液中加入10%血清，在Transwell上室分別滴加1×105 HeLa-pSRP、HeLa

12、-pSRP/MIF細(xì)胞懸液。將上室置于下室之中，在37℃溫箱孵育。16 h后取出上室，用棉簽將殘留在上室內(nèi)表面上的細(xì)胞拭去。上室經(jīng)PBS洗滌后，用4%多聚甲醛固定遷移至上室外表面上的細(xì)胞，細(xì)胞用含0．1%龍膽紫的20%乙醇染色20分鐘，用清水洗3遍，顯微鏡下（200×）計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取5個(gè)視野細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均值。 6. 劃痕試驗(yàn)。 HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF細(xì)胞鋪6孔板中，當(dāng)單細(xì)胞層生長(zhǎng)至95%時(shí)

13、，使用10μl槍頭對(duì)細(xì)胞進(jìn)行劃痕。分別于0，24小時(shí)，36小時(shí)，48小時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照，比較細(xì)胞劃痕愈合的速度。 7. 細(xì)胞粘附性實(shí)驗(yàn)。 室溫200μl/孔PBS洗滌2遍，胰酶消化HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml。每組分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加入100μl細(xì)胞懸液，37℃孵育1h后取出96孔培養(yǎng)板，用PBS洗滌2-3遍，去除未粘附細(xì)胞。含0．2%龍膽紫的

14、10%乙醇染色5分鐘，用PBS洗滌3-5遍，每孔加入100μl等體積混勻的0．1MNaH2PO4，PH4．5和50%乙醇以去除殘余染色。酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570nm讀數(shù)。 8. Western-blot檢測(cè)。 將篩選后的HeLa細(xì)胞株接種到6孔板中，培養(yǎng)至每孔0．1×106時(shí)，收集細(xì)胞。用適量細(xì)胞裂解液裂解，上樣，15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TTBS室溫封閉1-2小時(shí)，分別加入兔

15、抗人Cyclin D1、Bcl-2、Bax、FAK、AKT、ERK1/2、和ICAM-1多克隆抗體（1：1000稀釋），鼠抗人p53、p21單克隆抗體1：800稀釋，或小鼠抗人GAPDH單克隆抗體（1：1000稀釋）4℃孵育過(guò)夜。TTBS漂洗5min×3次；兔抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（1：5000稀釋）37℃孵育1h； TTBS漂洗5 min×3次；SuperSignal Weste Femto敏感曝光試劑盒曝光底片顯影。 統(tǒng)計(jì)

16、方法： 使用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果用平均值士標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，以P<0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 論文小結(jié)： 1．成功構(gòu)建了針對(duì)人MIF基因的siRNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSRP/MIF1、pSRP/MIF2。獲得穩(wěn)定抑制MIF表達(dá)的細(xì)胞株HeLa-pSRP/MIF和表達(dá)空載體的對(duì)照組細(xì)胞HeLa-pSRP。 2．沉默MIF后的HeLa細(xì)胞對(duì)TNF-α和放線菌酮誘

17、導(dǎo)的凋亡減少，并且沉默MIF后細(xì)胞衰老減少。沉默MIF后細(xì)胞阻滯在G0/G1期，細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，遷移能力、粘附功能減弱。 3．本研究顯示MIF通過(guò)影響cyclinD1、p53、p21表達(dá)維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)周期；MIF通過(guò)促進(jìn)p53、p21的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞衰老。另外，MIF通過(guò)增加Bax表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MIF能促進(jìn)細(xì)胞Src、FAK、ICAM-1、AKT、ERK1/2的表達(dá)，可能是MIF維持細(xì)胞的生長(zhǎng)、移動(dòng)、粘附特性的機(jī)制之一。