巨噬細胞移動抑制因子與小分子相互作用的動力學(xué)研究.pdf

1、巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)，是一種重要的先天性免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)因子，在宿主抗微生物防衛(wèi)系統(tǒng)和應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用，涉及敗血癥、腫瘤炎癥和自身免疫性疾病等多種疾病的發(fā)病機制，并且具有酶的活性，能夠催化苯丙酮酸、D-多巴色素的異構(gòu)化反應(yīng)以及硫醇蛋白的氧化還原反應(yīng)。隨著MIF的特殊生物學(xué)功能及其在多種疾病中的重要作用日益為人們所確認，MIF已逐漸成為新的研究熱點。

2、 但目前關(guān)于MIF的研究主要采用實驗手段在組織細胞水平進行，較少從原子水平上進一步研究MIF的結(jié)構(gòu)、酶催化機理以及與抑制劑的相互作用。不同類型抑制劑與MIF具體的結(jié)合模式，同類抑制劑活性的差異，以及MIF突變體與這些分子作用模式的差異都沒有從原子水平得到合適的解釋。MIF與生物活性分子的結(jié)合過程中MIF構(gòu)象的動態(tài)變化，MIF重要氨基酸在催化反應(yīng)中的重要角色及其在MIF與不同底物、抑制劑結(jié)合過程中的作用需要進一步探討。 基

3、于以上問題，在實驗研究基礎(chǔ)上從理論計算角度對一些實驗無法解釋的現(xiàn)象從原子水平上深入分析，進一步探討MIF酶的催化機理，了解MIF的重要氨基酸在催化中的作用，研究抑制劑、底物等不同小分子與MIF及其突變體的特異性識別與結(jié)合親和性，動態(tài)研究MIF在與生物活性分子的結(jié)合過程中的構(gòu)象變化，比較MIF及其突變體與生物活性分子作用的差異。 本論文主要對MIF與8個對羥基苯丙烯酸類似物、5個底物分子、2個ISO-1類似物、5個香豆素衍生物分子

4、，以及MIF蛋白突變體P1G、K32A、N97A等與8個對羥基苯丙烯酸類似物的相互作用，利用分子對接和分子動力學(xué)模擬等計算工具進行了詳細的分析。 1．針對MIF對(E)-2-氟-對羥基苯丙烯酸類似物的立體化學(xué)選擇性，對MIF與6個苯丙烯酸類似物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)分別進行了分子動力學(xué)模擬，并采用MM-PBSA分析了復(fù)合物的結(jié)合自由能。MIF蛋白構(gòu)象非常穩(wěn)定，與苯丙烯酸類似物的結(jié)合并沒有對其構(gòu)象產(chǎn)生較大影響。MIF主要通過Asn-97’、

5、Pro-1、Lys-32與苯丙烯酸類似物形成氫鍵或鹽橋。順反類似物與MIF結(jié)合模式的最大區(qū)別在于，反式類似物與殘基Pro-1形成一個N-H…O氫鍵，而順式類似物無法與Pro-1形成任何氫鍵，這是造成順反類似物親和性差別的最主要原因，并且MM-PBSA分析也表明靜電作用是造成這種結(jié)合親和性差別的重要原因。 2．為研究MIF、MIF突變體與丙烯酸類似物相互作用的差別，以及重要殘基突變對蛋白構(gòu)象的影響，利用分子對接方法構(gòu)建了苯丙烯酸

6、類似物與MIF、P1G、K32A、N97A的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，并對這些復(fù)合物進行了分子動力學(xué)模擬。氫鍵分析發(fā)現(xiàn)反式苯丙烯酸類似物與MIF、P1G的結(jié)合模式存在很大區(qū)別，反式類似物與MIF通過殘基Pro-1形成一個N-H…O氫鍵，而與P1G則通過殘基Ile-64一個N-H…O氫鍵。順式類似物與MIF和P1G的結(jié)合模式?jīng)]有明顯區(qū)別，并沒有與Pro-1或Ile-64形成氫鍵。N97A突變體都通過殘基Ile-64與順式、反式類似物形成N-H…O氫鍵，

7、并與反式類似物通過殘基Lys-32形成一個鹽橋，而與順式類似物不形成此鹽橋。順式類似物僅與K32A的Asn-97’殘基形成一個O-H…O氫鍵，而反式類似物與K32A突變體的Asn-97’形成一個O-H…O氫鍵，與Ile-64形成一個N-H…O氫鍵。計算結(jié)合自由能的差別定性反映了順反類似物對P1G、K32A、NP7A突變蛋白可能的抑制活性的差異，預(yù)示著P1G、K32A、NP7A可能對苯丙烯酸類似物仍然存在一定的選擇性。對MIF蛋白三聚體、

8、單體、N97A、K32A突變體結(jié)構(gòu)也進行了動力學(xué)模擬，構(gòu)象并沒有太大變化，在納秒時間尺度上呈現(xiàn)為剛性，顯示重要殘基的突變對MIF蛋白的構(gòu)象影響較小。 3．為分析對羥基苯丙酮酸(HPP)、R-多巴色素(RDP)、R-和S-多巴色素甲酯(RDPM，SDPM)等底物與MIF結(jié)合的差異性，通過分子對接方法構(gòu)建了MIF與這些底物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，并進行了多重動力學(xué)模擬和MM-PBSA結(jié)合自由能分析。HPP主要與MIF的殘基Asn-97’和Il

9、e-64分別形成O-H…O氫鍵，N-H…O氫鍵，并且與殘基Lys-32形成鹽橋。RDP與Pro-1和Ile-64分別形成一個N-H…O氫鍵。SDPM與Pro-1和Asn-97’分別形成一個N-H…N氫鍵，O-H…O氫鍵，而RDPM僅與Pro-1形成一個穩(wěn)定性不強的N-H…O氫鍵。MM-PBSA分析表明底物與MIF的結(jié)合親和力從強到弱依次為RDPM，HPP，SDPM，RDP，這一分析與實驗結(jié)論一致說明了RDPM和SDPM是比RDP更好的M

10、IF底物。同時MM-PBSA表明了范德華作用很大程度上決定了結(jié)合自由能大小，是MIF與這4個底物最重要的相互作用。 4．對MIF與ISO-1等2個類似物(R1，S1)的復(fù)合物進行了分子動力學(xué)模擬，以研究它們具體的結(jié)合模式，并采用MM-PBSA計算方法衡量了R型、S型ISO-1與MIF的結(jié)合自由能。R1、S1都只與MIF的殘基Asn-97’形成一個O-H…O氫鍵。MM-PBSA分析發(fā)現(xiàn)R型和S型的ISO-1的結(jié)合親和性存在明顯差

11、別，靜電作用是造成R1、S1結(jié)合親和性差異的一個最重要因素。 5．針對一系列高活性MIF抑制劑香豆素衍生物(A，B，C，D，E)，采用分子對接方法構(gòu)建了MIF與香豆素衍生物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。并對5個復(fù)合物進行了分子動力學(xué)模擬。分析發(fā)現(xiàn)5個香豆素衍生物分子均與MIF的殘基Asn-97’形成一個O-H…O氫鍵，分子A和E分別與殘基Ile-64形成一個N-H…O氫鍵，而分子B、C、D都與殘基Pro-1形成一個N-H…O氫鍵。這5個分子處在