CytoMPS原位疫苗治療肝癌的抗瘤作用及其免疫效應(yīng).pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界性的常見(jiàn)腫瘤，在我國(guó)占據(jù)惡性腫瘤死亡率的第二位。外科手術(shù)切除是目前最有效的肝癌治療手段，但是超過(guò)70％的患者在初次就診時(shí)因腫瘤進(jìn)展或肝功能不全而無(wú)法接受手術(shù)治療。切除術(shù)后兩年內(nèi)30-50％腫瘤復(fù)發(fā)，五年復(fù)發(fā)率可高達(dá)80％，復(fù)發(fā)性肝癌能獲得再切除者僅10-20％。由于外科治療的應(yīng)用受到嚴(yán)重限制，事實(shí)上絕大多數(shù)的病人需要接受非手術(shù)治療。 抗腫瘤免疫是有發(fā)展前途

2、的治療方法之一，抗腫瘤免疫需要腫瘤抗原、抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cells，APCs)和效應(yīng)細(xì)胞的參與，局部高濃度的細(xì)胞因子能夠顯著放大已產(chǎn)生的抗腫瘤免疫。近年來(lái)有學(xué)者將大劑量的生物活性細(xì)胞因子(IL-2，IL-12等)注入小鼠活體瘤內(nèi)，結(jié)果產(chǎn)生了保護(hù)性免疫，顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)。我們已經(jīng)成功地建立含有小劑量白介素-2(interleukin-2，IL-2)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-

3、macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)的緩釋微粒，并和切除的HCC組織一起配制了一種自體瘤苗以預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)并取得了顯著效果。在此基礎(chǔ)上本研究建立小鼠皮下移植性肝癌模型，對(duì)模型施行瘤組織內(nèi)注射細(xì)胞因子緩釋微粒(cytokines microparticles，CytoMPS)制作成原位瘤苗(in situ vaccine，ISV)，觀測(cè)CytoMPS-ISV治療肝癌的抗瘤作用，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)室

4、檢測(cè)探討CytoMPS-ISV可能的抗腫瘤免疫效應(yīng)。 第一部分： CytoMPS原位疫苗的抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn) 材料和方法： 1.小鼠皮下移植性肝癌模型的建立：常規(guī)體外培養(yǎng)小鼠Hepa 1-6肝癌細(xì)胞，于C57BL/6J小鼠皮下接種1×107個(gè)Hepa 1-6細(xì)胞建立小鼠皮下移植性肝癌模型。七天后可捫及皮下結(jié)節(jié)。用游標(biāo)卡尺測(cè)量其長(zhǎng)徑(L)、短徑(W)，L>5 mm者被認(rèn)為接種成功，按V=(L×W×W)/2計(jì)算腫瘤體積

5、。 2.配制含有mIL-2和mGM-CSF的CytoMPS。 3.運(yùn)用已建立C57BL/6J小鼠Hepal-6細(xì)胞皮下移植肝癌模型，腫瘤長(zhǎng)至直徑5-7 mm時(shí)，瘤內(nèi)注射免疫緩釋微球，對(duì)照組注射PBS，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況及小鼠生存率，分別繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線和統(tǒng)計(jì)生存率。 結(jié)果： 與PBS注射組和對(duì)照組相比，瘤內(nèi)注射CytoMPS后腫瘤生長(zhǎng)受到顯著抑制(P<0.01，P<0.01)，但3組的小鼠生存率無(wú)顯著差異(

6、P>0.05)。 結(jié)論： 細(xì)胞因子免疫緩釋微球瘤內(nèi)注射可以顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，但不能改善小鼠生存率。 第二部分： CytoMPS-ISV聯(lián)合手術(shù)切除的抗瘤作用 材料和方法： 1.按第一部分方法建立小鼠皮下移植性肝癌模型、制備細(xì)胞因子緩釋微球，并按同樣方法進(jìn)行瘤內(nèi)注射CytoMPS，制備CytoMPS-ISV。 2.CytoMPS-ISV聯(lián)合手術(shù)切除的抗瘤作用：CytoMPS組、PBS組和空白

7、對(duì)照組第三次瘤內(nèi)注射后3天手術(shù)去除腫瘤灶，對(duì)側(cè)脅腰部皮下再接種1.0×107 Hepa1-6細(xì)胞，觀察三組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況及小鼠生存率。 結(jié)果： 與PBS注射組及空白對(duì)照組相比，聯(lián)合治療后，CytoMPS-ISV后聯(lián)合手術(shù)組有37.5％(3/8)的小鼠獲得保護(hù)，無(wú)瘤長(zhǎng)期生存；PBS瘤內(nèi)注射后聯(lián)合手術(shù)組和對(duì)照組全部生成腫瘤。且CytoMPS-ISV后聯(lián)合手術(shù)組有腫瘤生長(zhǎng)的小鼠對(duì)比PBS瘤內(nèi)注射后聯(lián)合手術(shù)組和對(duì)照組，腫瘤生

8、長(zhǎng)受到顯著抑制(P<0.01，P<0.01)，生存率顯著提高(P<0.01，P<0.01)。 結(jié)論： 細(xì)胞因子免疫緩釋微球瘤內(nèi)注射可以顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，CytoMPS-ISV后聯(lián)合手術(shù)切除原發(fā)腫瘤，CytoMPS-ISV后聯(lián)合手術(shù)組產(chǎn)生保護(hù)性免疫，可以顯著抑制再接種腫瘤的生長(zhǎng)，可以顯著增加小鼠的生存率。 第三部分： CytoMPS-ISV抗腫瘤免疫效應(yīng)的檢測(cè) 材料和方法： 1.流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血

9、淋巴細(xì)胞變化：CytoMPS第三次注射后3天后處死小鼠，無(wú)菌下摘除眼球，經(jīng)眼動(dòng)脈取血，肝素抗凝處理，1小時(shí)內(nèi)送流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T和NK細(xì)胞變化。 2.疫苗誘導(dǎo)體外CTL和NK細(xì)胞的殺瘤活性檢測(cè)：CytoMPS第三次注射后3天后處死小鼠，無(wú)菌取小鼠脾臟，分離脾淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)7天，LDH釋放法測(cè)定CTL和NK細(xì)胞的殺瘤活性，靶細(xì)胞為Hepa 1-6細(xì)胞、B16黑色素瘤細(xì)胞和Yac-1細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞與

10、靶細(xì)胞的比例為20：1。 3.采用免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織的CD4+、CD8+和NK1.1+細(xì)胞浸潤(rùn)情況。 4.疫苗誘導(dǎo)CTL的抗體阻斷作用：分離的脾CTL經(jīng)過(guò)單克隆抗體(CD4+、CD8+、MHC-Ⅰ，Ⅱ)預(yù)處理30分鐘后進(jìn)行CTL細(xì)胞毒性試驗(yàn)(LDH釋放法)。 結(jié)果：瘤內(nèi)注射CytoMPS組血液中及局部浸潤(rùn)的CD4+、CD8+和NK細(xì)胞明顯高于PBS組和對(duì)照組(P<0.05)；淋巴細(xì)胞殺傷試驗(yàn)結(jié)果顯示瘤內(nèi)注射C

11、ytoMPS組的脾CTL和NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率明顯高于PBS組對(duì)照組(P<0.02，P<0.05)；抗體阻斷作用試驗(yàn)顯示：接種疫苗的小鼠脾CTL的殺瘤活性可被抗—CD8+、抗-MHC-Ⅰ單克隆抗體所阻斷，但不被抗-CD4+、抗-MHC-Ⅱ單克隆抗體所阻斷。因此，其殺瘤特性是由MHC-Ⅰ限制的CD8+T細(xì)胞所介導(dǎo)。 結(jié)論： CytoMPS-ISV能誘導(dǎo)機(jī)體的產(chǎn)生以CD8+T細(xì)胞為主的抗腫瘤免疫作用，其殺瘤機(jī)制是由MHC