光動力學療法治療小鼠Heps肝癌移植瘤免疫效應的實驗研究.pdf

1、目的:本課題應用光動力學療法(photodynamic therapy，PDT)對小鼠肝癌移植瘤進行實驗性治療。觀察PDT對荷瘤小鼠腫瘤生長和生存期的影響，以及PDT對荷瘤小鼠全身和腫瘤局部免疫效應的影響，探討光動力學療法的免疫效應機理，為肝癌的臨床治療提供實驗依據(jù)；觀察PDT與卡介苗(Bacillus Calmette Guerin，BCG)局部免疫治療聯(lián)合應用后對腫瘤生長和免疫效應的影響，探討聯(lián)合治療的可行性及有效性，為肝癌的臨床綜

2、合治療提供新的途徑和新的思路。 方法:建立小鼠Heps肝癌移植瘤模型96只，待移植瘤的長徑達到0.8～1.2cm時，隨機分為荷瘤對照組、PDT組、免疫治療組和光動力免疫治療(photodynamicimmunotherapy，PDIT)組，每組均24只小鼠。PDT組每只小鼠尾靜脈注入光敏劑PSD-007 20 mg/kg體重，7小時后照射腫瘤局部。光斑直徑2cm，功率密度為190～200 mW/cm<'2>，能量密度為170～1

3、80 J/cm<'2>。免疫治療組的荷瘤小鼠腫瘤局部注射BCG 1×10<'7>CFU。光動力免疫治療組于PDT后即時在荷瘤小鼠的腫瘤局部注射BCG1×10<'7>CFU。1.待瘤結(jié)節(jié)長出后隔日觀測四組荷瘤小鼠的腫瘤大小，計算腫瘤體積和治療后14天的抑瘤率；2.記錄接種當天開始至荷瘤小鼠死亡的時間。荷瘤小鼠全部于接種后90天處死，計算四組荷瘤小鼠90天生存率。3.四組分別于治療后2小時、24小時以及7天分批處死6只荷瘤小鼠，瘤組織取材，

4、常規(guī)病理組織學切片，HE染色，光學顯微鏡觀察。4.四組荷瘤小鼠分別于治療后2小時、24小時尾靜脈采血并涂片，測定其外周血白細胞計數(shù)和白細胞分類計數(shù)；5.取四組荷瘤小鼠治療后2小時、24小時以及7天的瘤組織切片，F(xiàn)4/80抗體免疫組織化學染色計數(shù)腫瘤局部組織的巨噬細胞(macrophages，MФ)數(shù)量；6.取四組荷瘤小鼠上述時間點的瘤組織切片，甲苯胺蘭染色計數(shù)腫瘤局部組織的肥大細胞(mast cell，MC)數(shù)量；7.取四組荷瘤小鼠上述

5、時間點的血清，雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測荷瘤小鼠外周血中的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α和白細胞介素(interleukin，IL)-1β的分泌水平。 結(jié)果 1.PDT組、PDIT組以及免疫治療組治療后7天以及14天的移植瘤的體積較荷瘤對照組均明顯縮小(P<0.01)。PDT組、PDIT組治療后

6、7天以及14天的腫瘤體積較免疫治療組均明顯縮小(P<0.01)。PDIT組治療后7天的腫瘤體積較單純PDT組明顯縮小(P<0.05)。PDT組、免疫治療組和PDIT組治療后14天的抑瘤率分別為97.95％、21.48％、98.26％。 2.PDT組荷瘤小鼠的90天生存率(83.33％)和PDIT組荷瘤小鼠的90天生存率(100％)明顯高于荷瘤對照組(0)，P<0.05。PDIT組荷瘤小鼠的90天生存率明顯高于單純免疫治療組(33

7、.33％)，P<0.05。而PDT組和PDIT組、PDT與免疫治療組、免疫治療組與荷瘤對照組的生存率之間差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05。 3.HE 染色結(jié)果顯示，荷瘤對照組腫瘤細胞分布密集，腫瘤組織內(nèi)瘤細胞壞死、液化少見，腫瘤間質(zhì)無纖維組織增生，腫瘤內(nèi)僅見少量免疫細胞浸潤。PDT組治療后2小時可見腫瘤細胞退變明顯，核固縮空泡變性，其中大量中性粒細胞浸潤；PDT后24小時可見大片腫瘤細胞壞死，胞膜破裂、崩解，核碎裂、游離或溶解，腫

8、瘤細胞結(jié)構(gòu)不清；PDT后7天可見到大片呈凝固性壞死改變的腫瘤細胞，細胞形態(tài)消失，被均勻粉染的無結(jié)構(gòu)物質(zhì)取代。壞死區(qū)外緣均可見大量中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，壞死細胞間可見纖維結(jié)締組織增生，其中有不同程度的巨噬細胞浸潤。單純免疫治療組治療后2小時，腫瘤細胞壞死不明顯，間質(zhì)中大量炎性細胞浸潤。治療后24小時，腫瘤組織壞死呈灶樣分布，間質(zhì)中大量炎性細胞浸潤。治療后7天，腫瘤組織壞死無明顯變化，間質(zhì)中大量炎性細胞浸潤。PDIT組治療后可見腫瘤組織

9、壞死明顯，較單純PDT組壞死面積更大，伴有大量中性粒細胞和巨噬細胞浸潤。 4.荷瘤小鼠外周血白細胞總數(shù)和分類測定結(jié)果顯示，治療后2小時，PDT組的荷瘤小鼠外周血中性粒細胞數(shù)量為(8.92±1.03)×10<'9>/L，PDIT組的荷瘤小鼠外周血中性粒細胞數(shù)量為(9.26±1.22)×10<'9>/L，均明顯高于荷瘤對照組的(4.07±0.55)×10<'9>/L和單純免疫治療組的(4.19±0.69)×10<'9>/L，P<0.

10、01。治療后24小時，PDT組的荷瘤小鼠外周血中性粒細胞數(shù)量為(18.24±3.55)×10<'9>/L，PDIT組的荷瘤小鼠外周血中性粒細胞數(shù)量為(19.58±4.13)×10<'9>/L，均明顯高于荷瘤對照組的(4.07±0.55)×10<'9>/L和單純免疫治療組的(3.97±0.58)×10<'9>/L，P<0.01。 5.免疫組化染色結(jié)果顯示，PDT組和PDIT組治療后2小時、24小時以及7天腫瘤局部巨噬細胞數(shù)量，均明

11、顯高于荷瘤對照組和單純免疫治療組(P<0.01)。PDIT組上述時間點腫瘤局部巨噬細胞數(shù)量，明顯高于單純PDT組(P<0.05)。單純免疫治療組治療后24小時和治療后7天腫瘤局部巨噬細胞數(shù)量，明顯高于荷瘤對照組(P<0.01)。 6.甲苯胺蘭染色結(jié)果顯示，PDT組和PDIT組治療后24小時和7天的腫瘤局部肥大細胞數(shù)量，均明顯高于荷瘤對照組和單純免疫治療組(P<0.01)。PDIT組治療后2小時和治療后7天的腫瘤局部肥大細胞數(shù)量，

12、均明顯高于單純PDT組(P<0.01)。 7.ELISA結(jié)果顯示，PDT組和PDIT組治療后2小時、24小時以及7天血清中細胞因子IL-1β和TNF-α的水平，均明顯高于荷瘤對照組和單純免疫治療組(P<0.01)。PDIT組治療后24小時和7天血清中細胞因子IL-1β和TNF-α的水平，均明顯高于單純PDT組(P<0.05)。免疫治療組治療后2小時、24小時以及7天血清中細胞因子IL-1β和TNF-α的水平，均明顯高于荷瘤對照組

13、(P<0.01)。 結(jié)論 1.PDT可使肝癌細胞變性、壞死，腫瘤體積縮小，達到殺滅原發(fā)灶的目的，并明顯提高荷瘤小鼠的生存率。 2．PDT后荷瘤小鼠腫瘤局部巨噬細胞和肥大細胞浸潤均明顯增加，外周血中性粒細胞數(shù)量迅速增高，血清中細胞因子IL-1β和TNF-α的水平明顯增高。提示PDT可增強荷瘤宿主全身和腫瘤局部的免疫力。 3．PDT聯(lián)合局部注射卡介苗的治療方法可明顯抑制小鼠肝癌的生長，提高荷瘤小鼠的生存率。聯(lián)