CCL3在多發(fā)性骨髓瘤骨病成骨受抑機制中的作用研究.pdf

1、目的：
　　體外培養(yǎng)多發(fā)性骨髓瘤骨病(Myeloma bone disease，MBD)患者骨髓來源成骨細(xì)胞，鑒定其生物學(xué)性狀，并與健康志愿者骨髓來源的成骨細(xì)胞比較其數(shù)量及成骨潛能差異。初步探討CCL3對MBD患者成骨細(xì)胞數(shù)量及功能的影響及可能機制。
　　方法：
　　第一部分:選擇新確診的多發(fā)性骨髓瘤骨病患者10例，健康志愿者8名作為研究對象。采用密度梯度離心法分離骨髓單個核細(xì)胞(BMMNC)，應(yīng)用地塞米松、β-甘油磷

2、酸鈉及維生素C誘導(dǎo)并純化獲得多發(fā)性骨髓瘤骨病患者成骨細(xì)胞（osteoblast, OB），以堿性磷酸酶(ALP)染色及Von Kossa' s鈣染色鑒定成骨細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測定培養(yǎng)獲得的成骨細(xì)胞表面CD138-CD45-CD34-表達(dá)以測定其純度。比較MBD患者及健康志愿者成骨細(xì)胞生物學(xué)特征及成骨潛能差異。采用FCM分別檢測MBD患者及健康志愿者成骨細(xì)胞膜CCR1的表達(dá)水平。
　　第二部分:選擇21例新確診的MBD患者作

3、為研究對象，骨髓培養(yǎng)法體外培養(yǎng)其骨髓來源的成骨細(xì)胞，以堿性磷酸酶染色及Von Kossa's鈣染色鑒定成骨。將傳代獲得的第三代成骨細(xì)胞以相同密度接種后分為三組進(jìn)行干預(yù):①空白對照組，②CCL3組，加入CCL350ng/ml，③CCL3及anti-CCL3組（anti-CCL3組），分別加入CCL350ng/ml及CCL3中和抗體5μg/ml。培養(yǎng)后比較三組間細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)的差異，Von Kossa' s鈣染色計數(shù)各組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量，比較各組

4、成骨潛能。ELISA法檢測各組培養(yǎng)上清骨鈣素(Osteocalcin，OCN)的濃度，RT-PCR分別檢測干預(yù)后各組成骨細(xì)胞Runx2、Wnt及Osterix mRNA的表達(dá)水平并進(jìn)行組間比較。
　　結(jié)果：
　　第一部分:1.經(jīng)地塞米松、β-甘油磷酸鈉及維生素C聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的貼壁細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，有較多突起，堿性磷酸酶染色及Von Kossa's鈣染色均為陽性，提示培養(yǎng)獲得的細(xì)胞為成骨細(xì)胞，經(jīng)FCM測定細(xì)胞表面CD138-

5、CD45-CD34-的表達(dá)，證實獲得的成骨細(xì)胞純度達(dá)90％以上，滿足進(jìn)一步實驗需求。培養(yǎng)獲得的成骨細(xì)胞生長曲線均為S型，MBD患者OB倍增時間約22小時，健康對照組為20小時。ALP染色可見MBD患者陽性細(xì)胞數(shù)少于正常對照組。Von Kossa's鈣染色后，MBD組鈣結(jié)節(jié)數(shù)也少于正常對照組。2.培養(yǎng)獲得的成骨細(xì)胞表面表達(dá)CCL3的受體CCR1，且MBD患者CCR1的表達(dá)為(74.48±7.31)％，高于對照組(48.35±8.81)％，

6、差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　第二部分:1.培養(yǎng)基中加入CCL3干預(yù)后，成骨細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)無明顯變化，鈣結(jié)節(jié)數(shù)量減少，礦化能力下降。2.MBD患者成骨細(xì)胞培養(yǎng)上清中OCN的表達(dá):CCL3組培養(yǎng)上清中OCN水平為(750.643±41.116)μg/L，較空白組[(803.375±40.654)μg/L]明顯減低(P＜0.05);加入拮抗劑組OCN濃度為(787.358±32.063)μg/L，高于CCL3組(P＜0.05)，與空白組比

7、較無統(tǒng)計學(xué)差異。3.MBD患者成骨細(xì)胞Runx2、Wnt及Osterix mRNA的表達(dá)水平:成骨細(xì)胞Runx2 mRNA表達(dá)與空白組(1.00)比較，CCL3組為(0.4002±0.3734)，低于空白組(P＜0.01)及anti-CCL3組(0.8670±0.6827，P＜0.05)，anti-CCL3組表達(dá)水平與空白組無統(tǒng)計學(xué)差異。Wnt mRNA的表達(dá)，CCL3組為(0.7341±0.4432)，anti-CCL3組為(0.82

8、46±0.3579)，組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異。Osterix mRNA在CCL3組的表達(dá)水平(0.5242±0.2809)低于空白組及anti-CCL3組(0.7993±0.2468)(P＜0.05)，空白組與anti-CCL3組的表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.采用密度梯度離心分離骨髓單個核細(xì)胞，骨髓培養(yǎng)法可體外培養(yǎng)獲得MBD患者成骨細(xì)胞。MBD患者成骨細(xì)胞數(shù)量、增長速率及成骨潛能較正常組下降。
　　2.C