PDGFs-PDGFRs信號(hào)通路在去氧皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化的作用及其可能的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:心肌纖維化(Myocardial fibrosis,MF)是心肌間質(zhì)中類(lèi)成纖維細(xì)胞過(guò)量增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積與降解失衡的病理過(guò)程,是多種心血管疾病的終末病理表現(xiàn)。型和Ⅲ型膠原蛋白是導(dǎo)致MF的主要膠原蛋白類(lèi)型。心肌纖維化一方面可致心室壁僵硬度增加、舒張順應(yīng)性下降,早期出現(xiàn)舒張期充盈受限,晚期導(dǎo)致心肌收縮功能損害,促發(fā)心力衰竭;另一方面由于纖維化心肌組織的電傳導(dǎo)異常,?？蓪?dǎo)致多種惡性心律失常的發(fā)生,甚至是猝死。目前認(rèn)

2、為,心肌纖維化與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)、成纖維細(xì)胞、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和生長(zhǎng)因子等有關(guān),是各種刺激誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)的最終結(jié)局。目前已經(jīng)得到公認(rèn)的是心肌纖維化發(fā)生與體內(nèi)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)作用密切相關(guān),血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)和AngⅡ受體抑制劑(ARB)類(lèi)藥物臨床應(yīng)用的相關(guān)研究結(jié)果顯示兩者均具有一定減輕或逆轉(zhuǎn)心肌纖維化、心室重塑及改善心血管疾病預(yù)后的作用,反映出RAAS在MF發(fā)生、發(fā)展過(guò)

3、程中的重要作用地位。近年來(lái)作為RAAS下游組成部分的醛固酮(Aldosterone;ALD)和去氧皮質(zhì)酮(Deoxycorticosterone;DOCA)所代表的鹽皮質(zhì)激素導(dǎo)致心肌纖維化發(fā)生的觀點(diǎn)得到更多研究證實(shí),但其具體作用的分子機(jī)制仍不清楚,相關(guān)研究已成為心肌纖維化防治領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　既往在去氧皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化模型中進(jìn)行的研究表明,鹽皮質(zhì)激素增多能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生心肌纖維化,而且發(fā)現(xiàn)DOCA/salt誘導(dǎo)

4、的大鼠心肌纖維化中PDGFs/PDGFRs信號(hào)通路參與了心肌纖維化的形成,觀察到心肌組織炎癥反應(yīng)增加的現(xiàn)象。抑制單核/巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)可以減少心肌纖維化,表明炎癥反應(yīng)在心肌纖維化中發(fā)揮作用。然而心肌組織的炎癥反應(yīng)是否與PDGFs/PDGFRs信號(hào)通路有關(guān),尚沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。此外,PDGFs/PDGFRs信號(hào)通路通過(guò)何種途徑參與心肌纖維化進(jìn)程目前尚不清楚。已有研究顯示,心臟成纖維細(xì)胞有潛在分化成肌成纖維細(xì)胞的作用,且在心肌梗死后心肌纖維化

5、的研究中推測(cè)PDGFs/PDGFRs信號(hào)通路調(diào)節(jié)心肌纖維化進(jìn)程很可能是通過(guò)直接刺激成纖維細(xì)胞增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,大量合成膠原蛋白的結(jié)果。但體內(nèi)研究尚未得到證實(shí)。
　　本研究通過(guò)建立去氧皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化模型,觀察心肌組織的單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、PDGFs及其受體PDGFRs表達(dá)情況、PDGFRs細(xì)胞表達(dá)類(lèi)型以及心臟成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量變化,并進(jìn)一步分別采用法舒地爾和伊馬替尼進(jìn)行干預(yù)性治療,探討醋

6、酸去氧皮質(zhì)酮(DOCA)誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化中炎癥反應(yīng)增加是否能夠過(guò)度激活血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGFs)信號(hào)通路和PDGFs/PDGFRs信號(hào)通路在去氧皮質(zhì)酮(DOCA)誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化的作用及其對(duì)心臟成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法:1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:實(shí)驗(yàn)開(kāi)始階段給予大鼠10％水合氯醛(400 mg·kg-1)腹腔麻醉,行右腎切除術(shù),術(shù)后1周開(kāi)始給予1%氯化鈉及0.2%氯化鉀飲水,

7、隨機(jī)分為4組,每組10或20只:(1)對(duì)照組(CON組):注射用大豆油4天一次皮下注射及蒸餾水每天灌胃一次;(2)去氧皮質(zhì)酮組(DOCA組):去氧皮質(zhì)酮60 mg·kg-1·4d-1皮下注射及蒸餾水每天灌胃一次;(3)去氧皮質(zhì)酮+伊馬替尼組(DOCA+IMA組):去氧皮質(zhì)酮60 mg·kg-1·4d-1皮下注射,同時(shí)給予伊馬替尼60 mg·kg-1·d-1灌胃,每天一次;(4)去氧皮質(zhì)酮+法舒地爾組(DOCA+FAS組):去氧皮質(zhì)酮60

8、 mg·kg-1·4d-1皮下注射,同時(shí)給予法舒地爾10 mg·kg-1·d-1灌胃,每天兩次。其中CON組灌胃用蒸餾水體積與另兩組灌胃藥物所溶蒸餾水體積相同,CON組皮下注射大豆油體積與另兩組皮下注射藥物所溶大豆油體積相同。
　　2.血壓測(cè)定:使用尾套法測(cè)定大鼠動(dòng)脈收縮壓(SBP),分別于干預(yù)前、干預(yù)第14天及第28天尾套法測(cè)定各組大鼠收縮壓。3.蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心肌組織炎癥反應(yīng)情況。4.苦味酸-天狼猩紅染色觀察大鼠

9、心肌間質(zhì)纖維化程度和心肌血管周?chē)z原面積(PVCA)/血管腔面積(VA)比值。5.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法檢測(cè)心肌組織成纖維細(xì)胞特異蛋白-1（FSP-1,S100A4)、α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、前膠原蛋白Ⅰ(procollagenⅠ)、前膠原蛋白Ⅲ(procollagenⅢ)、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、PDGFRα及PDGFRβ的mRNA含量。6.免疫組化法觀察心肌組織單核巨噬細(xì)胞抗原(ED-1)、心

10、肌組織波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)以及血小板源性生長(zhǎng)因子受體(PDGFRα、PDGFRβ)及磷酸化的PDGFRβ(p-PDGFRβ)蛋白表達(dá)。7.免疫熒光法定位PDGFRα、PDGFRβ表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)干預(yù)第14天DOCA組和DOCA+FAS組大鼠SBP顯著升高,兩組相比無(wú)明顯差異(P>0.05),但均顯著高于 CON組(P<0.01)。干預(yù)第14天和第28天血壓測(cè)定結(jié)果顯示

11、DOCA及 DOCA+IMA組大鼠 SBP均明顯高于 CON組(P<0.01),而DOCA組與DOCA+IMA組SBP無(wú)差異(P>0.05)。(2)干預(yù)第14天DOCA組炎癥反應(yīng)、ED-1較CON組明顯增加,PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGFRα、PDGFRβmRNA的表達(dá)不同程度增加,PDGFRα、PDGFRβ蛋白表達(dá)也增加(P<0.01),而PDGF-D mRNA表達(dá)未增加,使用具有抗炎作用的法舒地爾后,DOCA+F

12、AS組炎癥反應(yīng)較DOCA組明顯減少,PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGFRαmRNA的表達(dá)、PDGFRα蛋白表達(dá)減少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),但PDGFRβmRNA和蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯降低(P>0.05)。(3)干預(yù)第28天DOCA組心肌間質(zhì)纖維化程度和PVCA/VA比值明顯高于CON組(P<0.01),DOCA+IMA組心肌間質(zhì)纖維化程度和PVCA/VA比值雖高于CON組(P<0.05),但較DOCA組顯著減小(P<

13、0.01)。(4)干預(yù)第14天DOCA組較CON組PDGFRα、PDGFRβmRNA表達(dá)增加(P<0.01),DOCA+IMA組較 DOCA組 PDGFRα、PDGFRβ mRNA表達(dá)減少(P<0.01)。干預(yù)第28天與CON組相比,DOCA組PDGFRβ、FSP-1、α-SMA、procollagenⅠ、procollagenⅢmRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01),而PDGFRαmRNA表達(dá)未見(jiàn)明顯增加,組內(nèi)比較顯示PDGFRβ mR

14、NA表達(dá)大于PDGFRα,DOCA+IMA組較DOCA組PDGFRβ、FSP-1、α-SMA、procollagenⅠ、procollagenⅢmRNA表達(dá)減少(P<0.01)。(5)干預(yù)第14天與CON組相比,DOCA組PDGFRα、PDGFRβ蛋白表達(dá)增加(P<0.01),DOCA+IMA組較DOCA組PDGFRα蛋白表達(dá)減少(P<0.01)。干預(yù)第28天與CON組相比,DOCA組PDGFRβ、p-PDGFRβ蛋白表達(dá)明顯增加(P<

15、0.01),而PDGFRα蛋白表達(dá)量未見(jiàn)明顯增加(P>0.05),DOCA+IMA組較DOCA組 PDGFRβ、p-PDGFRβ蛋白表達(dá)減少(P<0.01)。干預(yù)第28天,CON組大鼠心臟間質(zhì)主要是vimentin陽(yáng)性的成纖維細(xì)胞,α-SMA表達(dá)的很少,DOCA組大鼠α-SMA陽(yáng)性的梭形細(xì)胞(顯然是肌成纖維細(xì)胞)數(shù)量明顯增加(P<0.01),DOCA+IMA組較DOCA組肌成纖維細(xì)胞數(shù)量均減少(P<0.05)。
　　結(jié)論:1.PD

16、GFRα主要在心肌纖維化早期發(fā)揮作用,PDGFRβ在全程均起作用,而且對(duì)血管纖維化也有作用。
　　2.PDGFRα和PDGFRβ表達(dá)主要位于心肌成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞中。
　　3.DOCA誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌成纖維細(xì)胞的大量增殖,肌成纖維細(xì)胞亦明顯增加。
　　4.單核巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞在DOCA誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化中起著關(guān)鍵作用。
　　5.DOCA誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化模型中

17、,大量膠原蛋白沉積于心肌間質(zhì),應(yīng)用酪氨酸激酶受體抑制劑可抑制PDGFRs活性,減少成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞及膠原蛋白含量。
　　6.在動(dòng)脈血壓無(wú)明顯差異的情況下,DOCA+IMA組大鼠心肌組織CVF及PVCA值較DOCA組均顯著減小,說(shuō)明伊馬替尼可不依賴(lài)于降低血壓抑制心肌纖維化發(fā)生。
　　7.DOCA誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌間質(zhì)有明顯的炎癥反應(yīng),炎癥反應(yīng)和PDGFs/PDGFRα信號(hào)通路均參與其中,伴隨著炎癥反應(yīng)的減少,

18、PDGFs/PDGFRα信號(hào)通路的表達(dá)隨之減少,表明 PDGFs/PDGFRα信號(hào)通路的過(guò)度激活與心肌炎癥反應(yīng)有關(guān)。
　　8.DOCA誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化可能機(jī)制是DOCA刺激單核/巨噬細(xì)胞上的鹽皮質(zhì)激素受體(MR)過(guò)度激活致使單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),炎癥反應(yīng)增加,單核/巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞增殖、募集滲出并分泌大量PDGFs,同時(shí)成纖維細(xì)胞亦分泌PDGFs,激活并結(jié)合成纖維細(xì)胞上的PDGFRs,打開(kāi)PDGFs/PDGFRs