PDGFR-β-PI3K-AKT信號(hào)通路在PDGF-BB誘導(dǎo)大鼠心肌成纖維細(xì)胞所致心肌纖維化中的作用.pdf

1、研究背景和目的：
　　心肌纖維化（Myocardial fibrosis；MF）是多種心血管疾病的終末期表現(xiàn)，其主要病理表現(xiàn)為心肌間質(zhì)中成纖維細(xì)胞（CFs）增殖、并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積。膠原蛋白占細(xì)胞外基質(zhì)的80％，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，I型膠原蛋白（ColⅠ）、III型膠原蛋白（ColⅢ）是心肌纖維化中的主要膠原蛋白類型[1]。成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是心肌纖維化時(shí)合成ColⅠ、ColⅢ的主要細(xì)胞。血

2、小板源性生長(zhǎng)因子-BB(PDGF-BB)是重要的促有絲分裂因子，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、膠原蛋白分泌，在心肌纖維化進(jìn)程中起重要作用[3]。但PDGF-BB通過(guò)何種方式激活成纖維細(xì)胞介導(dǎo)心肌纖維化目前還不是很明確，我們前期在去氧皮質(zhì)酮/鹽誘導(dǎo)的大鼠纖維化模型中的研究發(fā)現(xiàn)血小板源性生長(zhǎng)因子及其受體（PDGFs/PDGFRs）的表達(dá)均顯著增加，且其主要位于成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞中，并且發(fā)現(xiàn)血小板源性生長(zhǎng)因子受體-β（PDGFR-β）在成纖維

3、細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化、膠原分泌中起到主要作用[4,5]。PI3K/Akt信號(hào)通路是體內(nèi)一條重要的調(diào)控通路，參與調(diào)控細(xì)胞在增殖、遷移、分化和血管生成等方面的功能[6]。本研究通過(guò)觀察在培養(yǎng)純化的CFs中加入外源性PDGF-BB干預(yù)后，觀察CFs的增值、轉(zhuǎn)化，檢測(cè)膠原蛋白的合成及其受體和PDGFR-β/PI3K/Akt信號(hào)通路的表達(dá)，探討PDGF-BB在心肌纖維化中的作用及其可能的下游信號(hào)機(jī)制。
　　方法：
　　采用胰酶消化及差速貼

4、壁法分離純化CFs，免疫熒光法鑒定CFs純化的CFs隨機(jī)分成以下四組：空白對(duì)照組(CON組)、PDGF-BB組（P組）、PDGF-BB+IMA組（IMA組）、PDGF-BB+LY294002組（LY組）。上述各組條件培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時(shí)后采用MTT法測(cè)定 CFs在各組的增殖情況；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR測(cè)定各組PDGFR-α、PDGFR-β、膠原蛋白I（ColⅠ）、膠原蛋白III（ColⅢ）、PI3K和Akt的mRNA含量；Western B

5、lotting法檢測(cè)各組PDGFR-β、磷酸化的PDGFR-β（p-PDGFR-β）、PI3K、磷酸化的PI3K（p-PI3K）、ColⅠ、ColⅢ的蛋白表達(dá)情況。將CON組、P組及LY組三組細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)7天后免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)，以檢測(cè)CFs的轉(zhuǎn)化情況。
　　結(jié)果:
　　免疫熒光雙染鑒定顯示培養(yǎng)的細(xì)胞中心肌組織波動(dòng)蛋白（vimention）表達(dá)陽(yáng)性的CFs達(dá)90%，α-SMA陽(yáng)

6、性細(xì)胞10%；條件培養(yǎng)基培養(yǎng)7天后熒光顯微鏡下觀察到P組表達(dá)α-SMA的細(xì)胞高達(dá)90%，CON組幾乎無(wú)表達(dá)，二者比較P＜0.01,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LY組表達(dá)量為10%與P組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。分組培養(yǎng)48小時(shí)后MTT法測(cè)得P組細(xì)胞較CON組顯著增加（P＜0.01），而IMA組和LY組細(xì)胞較 P組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；PDGFR-β、Col I、Col III、PI3K和AKT的蛋白及mRNA表達(dá)量在

7、PDGF-BB刺激48小時(shí)后顯著增加，與CON組比較P＜0.01，給予IMA或者LY294002后通道蛋白PDGFR-β、PI3K的磷酸化明顯受到抑制（P＜0.05），PDGFR-β、PI3K和Akt mRNA的表達(dá)量較P組也相應(yīng)明顯下降（P＜0.01)，COl I、COl III在mRNA及蛋白水平較P組亦顯著下降（P＜0.01）；但PDGFR-αmRNA的表達(dá)量在四組處理中未見(jiàn)明顯變化，在給予PDGF-BB后PDGFR-β的表達(dá)量較