供者來源凋亡胸腺細(xì)胞輸注延長(zhǎng)皮膚移植物存活及其機(jī)制.pdf

1、目的：以異基因小鼠皮膚移植為模型，探討供者來源凋亡胸腺細(xì)胞輸注誘導(dǎo)同種異體移植物免疫耐受的效應(yīng)、細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)與分子機(jī)制，為設(shè)計(jì)防治移植排斥反應(yīng)的新策略提供線索。 方法：用地塞米松誘導(dǎo)供者小鼠（Balb/c，H-2d）胸腺細(xì)胞凋亡:采用DNA Ladde凝膠電泳法以及Annexin V/PI細(xì)胞染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；BALB/c小鼠胸腺細(xì)胞以PKH67 染色，誘導(dǎo)凋亡后，經(jīng)尾靜脈過繼輸注MHC型別完全不匹配的受者小鼠（C57

2、BL/6，H-2b），12個(gè)小時(shí)后，取其脾細(xì)胞以抗CD11c-PE抗體標(biāo)記樹突狀細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察樹突狀細(xì)胞吞噬凋亡的胸腺細(xì)胞；細(xì)胞過繼7天后，將BALB/c小鼠皮膚移植給C57BL/6小鼠，觀察移植物存活時(shí)間；皮膚移植后7天，取移植皮片，組織學(xué)檢測(cè)移植物組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)評(píng)價(jià)供者脾細(xì)胞刺激受者小鼠T細(xì)胞增殖的作用；RT-PCR檢測(cè)受者小鼠脾臟細(xì)胞TGF-β、IL-10、Foxp3的mRNA表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)

3、檢測(cè)受者小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞亞類。 結(jié)果： 一、誘導(dǎo)供者胸腺細(xì)胞凋亡并過繼輸注，及受者DC吞噬凋亡胸腺細(xì)胞的作用1．DNA Ladder 試驗(yàn)和Annexin V/PI染色檢測(cè)證實(shí)，地塞米松可顯著增強(qiáng)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡：經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率達(dá)58.7％，未經(jīng)誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞作為對(duì)照，在體外培養(yǎng)相同時(shí)間凋亡率為32.4％。2．BALB/c小鼠胸腺細(xì)胞以PKH67 預(yù)先染色，誘導(dǎo)凋亡后經(jīng)尾靜脈輸注至C57BL/6 小鼠體內(nèi)，1

4、2個(gè)小時(shí)后，取其脾細(xì)胞以抗CD11c-PE抗體標(biāo)記DC，激光共聚焦顯微鏡下可見PKH67+CD11c+，提示凋亡胸腺細(xì)胞被DC吞噬。 二、供者凋亡胸腺細(xì)胞過繼輸注延長(zhǎng)異基因小鼠皮膚移植物存活時(shí)間及其機(jī)制以BALB/c小鼠為供者，C57BL/6小鼠為受者，進(jìn)行背部皮膚移植。移植術(shù)前實(shí)驗(yàn)組通過尾靜脈輸注2.5×107供者凋亡胸腺細(xì)胞，并以PBS、地塞米松和第三方小鼠（C3H小鼠）作為對(duì)照。 1．移植物存活時(shí)間供者凋亡細(xì)胞過繼

5、輸注，能明顯延長(zhǎng)皮膚移植物存活時(shí)間：凋亡細(xì)胞處理組平均存活時(shí)間為17.750±3.956天，PBS組為10.250±1.389天，地塞米松組為15.625±1.685天，C3H組為10.500±1.927天。（n=8，p﹤0.01）。 2．移植皮片組織學(xué)檢查移植術(shù)后7天，取移植皮片制石蠟切片，常規(guī)HE 染色，觀察移植物組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與PBS對(duì)照組和C3H組相比，凋亡胸腺細(xì)胞組移植組織中單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，未出現(xiàn)毛細(xì)血管

6、淤血、間質(zhì)出血、動(dòng)脈炎和靜脈炎等現(xiàn)象；地塞米松組移植組織中單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)也比PBS 對(duì)照組和C3H組略為減少。 3．受者淋巴細(xì)胞增殖功能移植術(shù)后7天，取供者脾細(xì)胞再次刺激受者脾臟T細(xì)胞，檢測(cè)后者對(duì)供者同種抗原的再次應(yīng)答能力。結(jié)果顯示：凋亡胸腺細(xì)胞組受者脾臟T細(xì)胞對(duì)供者脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)顯著低于PBS 對(duì)照組和C3H組。 4．受者脾臟細(xì)胞因子mRNA表達(dá)移植術(shù)后7天，取供者脾細(xì)胞和淋巴結(jié)，提取總RNA，借助RT-PCR 檢測(cè)

7、TGF-β、IL-10、Foxp3的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示：凋亡胸腺細(xì)胞組脾臟TGF-β、IL-10、Foxp3的mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照組升高，差異有顯著性；地塞米松組脾臟IL-10、Foxp3的mRNA表達(dá)水平增高。（p﹤0.05）。 5．受者脾臟中DC亞類檢測(cè)移植術(shù)后7天，取供者脾細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC亞類。結(jié)果顯示：凋亡胸腺細(xì)胞組CD11c+B220+DC比例顯著增高；凋亡胸腺細(xì)胞組和地塞米松組CD11c+CD45R