供體凋亡細(xì)胞輸注誘導(dǎo)胰島移植免疫耐受的研究.pdf

1、研究背景：胰島移植作為一種潛在的可徹底治愈糖尿病的治療方法，長期以來倍受矚目，尤其2000年Edmonton方案的成功，為用胰島移植的方法治愈1型糖尿病開拓了廣泛的應(yīng)用前景。但是，該方案仍需應(yīng)用免疫抑制劑來抑制移植免疫排斥的發(fā)生，長期應(yīng)用免疫抑制劑必然會(huì)給移植病人帶來許多副作用和潛在的危險(xiǎn)性，如增加感染、腫瘤的發(fā)生率，有的免疫抑制劑本身對胰島細(xì)胞有毒性，可引起移植后的糖尿病。誘導(dǎo)胰島移植免疫耐受則可以避免長期服用免疫抑制劑的毒副作用，有

2、希望成為促進(jìn)移植后胰島長期存活的一種有效手段。近年來一些研究表明凋亡細(xì)胞能夠主動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，并能通過調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的途徑誘導(dǎo)免疫耐受。凋亡細(xì)胞可以抑制DC的成熟，而不成熟DC在向T細(xì)胞提呈抗原時(shí)不能提供充分的共刺激信號，從而誘導(dǎo)免疫耐受，另外，吞噬細(xì)胞在吞噬凋亡細(xì)胞的同時(shí)分泌抑制性淋巴因子，亦可誘導(dǎo)免疫耐受。因此，我們擬通過凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)胰島移植免疫耐受，探求延長移植胰島存活的方法。 目的：本實(shí)驗(yàn)旨在探討供者凋

3、亡細(xì)胞預(yù)輸注能否抑制受者對供者胰島移植物的排斥反應(yīng)，延長胰島移植物的存活時(shí)間，為尋找誘導(dǎo)胰島移植免疫耐受的新方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1、過氧化氫對體外培養(yǎng)人脾細(xì)胞的影響：采用研磨法獲得懸浮的人脾細(xì)胞，將細(xì)胞分組后給予相應(yīng)的生理鹽水或不同濃度的H2O2處理，運(yùn)用四唑鹽(MTT)比色法檢測線粒體功能，將細(xì)胞與AnnexinV-FITC/PI混合孵育后使用流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡細(xì)胞.； 2、人胰島細(xì)胞的分離純化：利用半自動(dòng)化

4、胰島分離裝置消化胰腺，COBE-2991不連續(xù)密度梯度法純化胰島細(xì)胞； 3、建立糖尿病動(dòng)物模型：以STZ(120mg/kg體重)經(jīng)腹腔注射，誘發(fā)KM小鼠實(shí)驗(yàn)性糖尿病(連續(xù)2次血糖≥20mmol/L)； 4、供體凋亡細(xì)胞輸注對供受體混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的影響：將糖尿病KM小鼠隨機(jī)分組，分別進(jìn)行Hanks液注射、正常供體細(xì)胞預(yù)輸注、供體凋亡細(xì)胞預(yù)輸注、供體壞死細(xì)胞預(yù)輸注，各組在預(yù)處理7天后取出脾臟分離淋巴細(xì)胞，與供體淋巴細(xì)胞進(jìn)行

5、混合培養(yǎng)，MTT法觀察受體淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)； 5、供體凋亡細(xì)胞輸注對胰島移植物的影響：將糖尿病KM小鼠隨機(jī)分組為Hanks液注射組、正常供體細(xì)胞預(yù)輸注、供體凋亡細(xì)胞預(yù)輸注及供體壞死細(xì)胞預(yù)輸注組，各組在預(yù)處理7天后行胰島移植，將1000IEQ的胰島細(xì)胞移植入各組糖尿病小鼠的腎包囊內(nèi)，比較各組移植物生存時(shí)間上的差異； 6、將不同組及不同時(shí)期的移植物取出做胰島素的免疫組化檢測。 結(jié)果：1、人脾細(xì)胞線粒體功能及凋亡率與H

6、2O2呈劑量－效應(yīng)關(guān)系，隨著H2O2濃度的增高，線粒體功能逐漸降低，而凋亡率則隨H2O2濃度的增高而增加.同時(shí)它們與H2O2處理時(shí)間也存在時(shí)間－效應(yīng)的關(guān)系。各處理組間細(xì)胞凋亡率存在顯著差異(P＜0.05)，以H2O2100μmol/L處理的細(xì)胞組于6h達(dá)到凋亡高峰(63.95±4.11)％； 2、純化后平均每條人胰腺可獲取胰島細(xì)胞(9.63±7.09)萬IEQ，純度為(34.4±14.0)％，胰島素釋放試驗(yàn)反應(yīng)良好，高糖時(shí)胰島素

7、的釋放量為低糖時(shí)的2.31倍； 3、以STZ(120mg/kg體重)經(jīng)腹腔注入的方法，可成功誘發(fā)KM小鼠的試驗(yàn)性糖尿病，糖尿病模型成功率為90％； 4、單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后，與預(yù)輸注Hanks液、供體正常細(xì)胞及供體壞死細(xì)胞的受體鼠淋巴細(xì)胞比較，預(yù)輸注供體凋亡細(xì)胞的受體鼠淋巴細(xì)胞對供體淋巴細(xì)胞刺激的增殖反應(yīng)明顯減弱，其刺激指數(shù)為1.46±0.16，其它三組分別為1.90±0.38、1.82±0.22、2.10±0.22(

8、P＜0.05)； 5、預(yù)輸注供者凋亡細(xì)胞組胰島移植物存活期明顯延長，為19.6±7.0天，而輸注Hanks液組、輸注供者正常細(xì)胞或壞死細(xì)胞組胰島移植物存活時(shí)間分別為5.6±0.9、6.0±1.6、5.5±1.0天； 6、輸注Hanks液組、輸注供者正常細(xì)胞或壞死細(xì)胞組在移植物被排斥后取出做組織切片，Insulin免疫組化染色檢測證實(shí)無胰島素陽性細(xì)胞存在。凋亡細(xì)胞預(yù)輸注組移植組移植物在移植受體血糖正常時(shí)取出作Insulin