間充質(zhì)干細(xì)胞輸注誘導(dǎo)小型豬胰島移植免疫耐受的研究.pdf

1、胰島移植重建胰島素分泌系統(tǒng)，是一種有望徹底根治糖尿病的治療方法。2000年，Edmonton方案的成功，標(biāo)志著胰島移植取得了突破性的進(jìn)展，從而帶動(dòng)了胰島移植臨床試驗(yàn)性治療在世界范圍內(nèi)廣泛展開。然而移植排斥反應(yīng)和免疫抑制劑長期乃至終身應(yīng)用所帶來的副作用和潛在危險(xiǎn)性如增加感染、腫瘤的發(fā)生等仍難以克服。目前普遍認(rèn)為，解決異體移植排斥反應(yīng)的關(guān)鍵在于誘導(dǎo)受體對(duì)供體的細(xì)胞、組織或器官產(chǎn)生免疫耐受。由于移植免疫耐受的機(jī)制十分復(fù)雜，盡管誘導(dǎo)免疫耐受的方

2、法眾多，但均未能達(dá)到完全可靠持久的特異性耐受。骨髓細(xì)胞輸注誘導(dǎo)穩(wěn)定的混合嵌合狀態(tài)能夠維持長期的器官移植免疫耐受，在嚙齒類動(dòng)物主要通過中樞刪除機(jī)制來實(shí)現(xiàn)。然而，傳統(tǒng)的骨髓細(xì)胞輸注雖能在短期內(nèi)達(dá)到混合嵌合狀態(tài)，但很快由于嵌合率的急劇下降而使免疫耐受狀態(tài)難以維持。近年來許多研究在骨髓細(xì)胞輸注的基礎(chǔ)上，對(duì)受體進(jìn)行多次特異性輸血或供體淋巴細(xì)胞輸注，以達(dá)到穩(wěn)定的混合嵌合狀態(tài)，然而這樣會(huì)增加移植物抗宿主?。╣raft versus host dise

3、ase GVHD）的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)對(duì)受體進(jìn)行的非特異性預(yù)處理也會(huì)帶來許多的臨床風(fēng)險(xiǎn)，限制了通過骨髓細(xì)胞嵌合體來達(dá)到器官移植耐受的臨床應(yīng)用。 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells MSCs）是存在于成人組織的多能干細(xì)胞，可以從成熟的骨髓、脂肪組織、胎盤、頭皮和多種胎兒組織中獲得，具有向骨組織、軟骨和脂肪等的多能分化的潛能。體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)MSCs在特定的條件下可以向肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)組織和胰島素陽性細(xì)胞等分化。

4、MSCs在心肌損傷的修復(fù)，骨代謝紊亂和多種代謝性疾病中顯示出很好的療效。除了以上的組織修復(fù)和再生功能外，最近還發(fā)現(xiàn)MSCs還具有逃脫免疫識(shí)別和抑制免疫反應(yīng)的特性。Itakura等同時(shí)把供體胰島細(xì)胞和MSCs植入大鼠的門靜脈，可以觀察到胰島移植物存活期延長的同時(shí)GVHD的發(fā)生率也降低。本實(shí)驗(yàn)室的研究也發(fā)現(xiàn)，對(duì)小鼠進(jìn)行抗CD154預(yù)處理后，聯(lián)合輸注MSCs和骨髓細(xì)胞比單純骨髓細(xì)胞輸注能維持更長時(shí)間的混合嵌合狀態(tài)，使胰島移植物存活時(shí)間延長。雖

5、然MSCs已成功的應(yīng)用于骨髓移植過程中發(fā)生GVHD的治療，但其在同種實(shí)體器官移植方面的研究還鮮見報(bào)道。 因此，本研究在傳統(tǒng)的骨髓細(xì)胞輸注誘導(dǎo)胰島移植免疫耐受的同時(shí)，對(duì)受體進(jìn)行MSCs輸注，以期找到一種更有效、更安全的誘導(dǎo)胰島移植免疫耐受的方法。由于MSCs容易從骨髓分離和擴(kuò)增，同時(shí)具有逃脫免疫識(shí)別和抑制免疫反應(yīng)的特性，所以在前期小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討其在誘導(dǎo)大動(dòng)物（小型豬）胰島移植免疫耐受中的作用。 目的：

6、 建立小型豬MSCs培養(yǎng)、擴(kuò)增及胰島分離純化的方法，初步探討MSCs聯(lián)合骨髓細(xì)胞輸注誘導(dǎo)同種異體小型豬胰島移植免疫耐受，觀察胰島移植物存活時(shí)間及血清胰島素的變化，為尋找誘導(dǎo)胰島移植免疫耐受的新方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1、MSCs分離培養(yǎng)、擴(kuò)增無菌條件下用含肝素注射器抽取動(dòng)物骨髓20mL，離心棄上清，將細(xì)胞輕緩加入預(yù)先配好ficoll-paque分離液的離心管中，1500r/min，離心30min，小心吸取中間交界面

7、的單核細(xì)胞層，PBS液洗滌兩次，加入L-DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/mL，置于37℃，5％CO2飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)，48h后換液去除未貼壁的細(xì)胞，此后每3～4天換液一次，依據(jù)貼壁培養(yǎng)法分離和擴(kuò)增MSCs，取第五代細(xì)胞作為移植供源，調(diào)整細(xì)胞數(shù)1×10/mL。 2、供體骨髓細(xì)胞制備無菌條件下抽取動(dòng)物骨髓約40mL1000r/min，離心10min，棄上清，收集細(xì)胞加入紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，1000r/min，離心1

8、0min，用Hank's液洗滌兩次，加入RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞為1×106/mL，臺(tái)盼藍(lán)染色記數(shù)檢測活細(xì)胞率。 3.糖尿病小型豬模型的建立和胰島移植動(dòng)物空腹12h，麻醉后將生理鹽水新鮮配制的5％四氧嘧啶（200mg/kg）耳緣靜脈注射，將連續(xù)兩次以上空腹血糖≥7.0mmol/L的動(dòng)物判定患了糖尿病。無菌條件下將胰島細(xì)胞1×105IEQ、骨髓細(xì)胞1×1010和/或MSCs1×108混勻，經(jīng)肝門靜脈輸入糖尿病小型豬體內(nèi)

9、，移植后監(jiān)測血糖、胰島素等的變化，連續(xù)兩次血糖大于11.1mmol/L，以第一次時(shí)間為排斥反應(yīng)的時(shí)間。 4.小型豬胰島細(xì)胞的分離純化放血處死動(dòng)物后摘取胰腺，胰管灌注膠原酶V，經(jīng)自制的半自動(dòng)胰腺消化裝置消化分離小型豬胰腺，胰腺消化物用自制的推進(jìn)式離心管結(jié)合HCA-Ficoll單一密度梯度液（1.096/mL）純化，雙硫腙（DTZ）對(duì)胰島進(jìn)行特異性染色，計(jì)數(shù)胰島細(xì)胞量和純度，并利用胰島素釋放試驗(yàn)檢測胰島細(xì)胞的功能。 5、實(shí)驗(yàn)

10、分組和處理同種異體西藏小型豬分別作供體和受體，A組：單純骨髓細(xì)胞輸注組；B組：間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合骨髓細(xì)胞輸注組。均在胰島移植時(shí)經(jīng)肝門靜脈輸注上述細(xì)胞。受體小型豬在胰島移植后第二及第五天肌肉注射環(huán)孢素A（CsA）做預(yù)處理，劑量為10mg/kg。 結(jié)果： 1、MSCs生長情況經(jīng)ficoll分離的原代骨髓單個(gè)核細(xì)胞鏡下呈圓形，24h后可見少量的貼壁細(xì)胞，大而扁平，極少呈梭形，48h后首次換液，貼壁細(xì)胞增多，細(xì)胞呈梭型，放射形，三

11、角形和不規(guī)則形，原代培養(yǎng)10天，貼壁細(xì)胞明顯增多且呈漩渦狀，懸浮細(xì)胞基本清除，80％融合時(shí)首次傳代。傳代后的細(xì)胞生長迅速，分布均勻，細(xì)胞呈現(xiàn)紡錘形、星形及不規(guī)則形等多種形態(tài)，細(xì)胞質(zhì)豐富，核仁明顯，細(xì)胞平行排列或漩渦狀生長。 2、純化后，平均每頭小型豬消化胰腺（15.62±1.09）g組織，平均每克小型豬胰腺組織可獲得胰島細(xì)胞團(tuán)（3025.83±350.28）IEQ，胰島純度為（75.97±3.15）％。純化后的胰島細(xì)胞高糖時(shí)胰島

12、素的釋放量為（35.31±2.09）mIU/L，為低糖時(shí)（12.87±0.94）mIU/L的2.74倍（P=0.000），提示純化后胰島細(xì)胞功能良好。 3、胰島移植物存活時(shí)間B組（17.33±4.16）天與A組（8.33±1.53）天相比顯著延長（P=0.025），說明MSC輸注能顯著的減少移植排斥反應(yīng)和有效的延長骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)的胰島移植免疫耐受。 4、MSCs聯(lián)合骨髓細(xì)胞輸注組各時(shí)間點(diǎn)糖尿病小型豬血清胰島素水平有差異（P

13、=0.000），移植前胰島素水平與移植后7天、移植后14天有顯著性差異（P值均為0.000），以移植后7天、14天較高。排斥后胰島素水平顯著下降；各處理組移植前胰島素水平無差異（P=0.700），MSCs聯(lián)合骨髓細(xì)胞輸注組在移植后14天的胰島素水平與單純骨髓細(xì)胞移植組有顯著性差異（P=0.000）。 結(jié)論： 1、密度梯度分離法和貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合是一種簡單、有效和經(jīng)濟(jì)的分離培養(yǎng)小型豬間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。 2.采用膠