間充質(zhì)干細胞糾正ITP Th1優(yōu)勢性表達和誘導免疫耐受機制的研究.pdf

1、目的：體外觀察骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)對特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)患者CD4+CD25+T細胞比例以及T細胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10功能的影響，并探討上述兩種調(diào)控作用之間的相關性，旨在探究MSCs調(diào)節(jié)ITP免疫平衡及誘導自身免疫耐受的機制，從而為ITP的臨床治療奠定初步的實驗基礎。 方法：采用Ficoll分離骨髓單個核細胞，通過體外培養(yǎng)，擴增出MSCs，并通過形態(tài)學特征及流式細胞術檢測其表面標志加

2、以鑒定；通過Ficoll分離法和尼龍棉柱法獲取正常人及ITP患者外周血T淋巴細胞，并應用流式細胞術檢測T細胞中CD4+CD25+T細胞比例；MSCs經(jīng)絲裂霉素MMC處理后按不同數(shù)量(2×103、1×104、5×104個細胞/孔)接種培養(yǎng)板作為基底層細胞，然后分別接種體外分離純化的異體ITP及正常人T淋巴細胞，于2d、4d、6d后各自收集T淋巴細胞及培養(yǎng)上清，采用EI.ISA測定T細胞分泌的細胞因子IL-2、IFN-γIL-4、IL-10

3、水平；并用流式細胞術檢測接種于骨髓MSCs的ITP患者CD4+CD25+T細胞比例。 結果：分離培養(yǎng)的骨髓MSCs貼壁生長呈梭形，原代細胞呈集落分布，10d左右達到融合，傳代細胞保持原代細胞的形態(tài)且增殖速度加快，6～7d即可達到融合；經(jīng)流式細胞儀檢測骨髓MSCs高表達CD29、CD105、CD166，低表達CD34、CD45、HLA-DR，3代以后的細胞中MSCs純度達到95％以上；尼龍棉柱法分離的T淋巴細胞純度可達到70％～8

4、0％左右。流式細胞儀檢測結果，ITP患者外周血CD4+CD25+T細胞數(shù)量及CD4+CD25+7CD4+比值均明顯低于正常對照組(P<0.05)；在PHA作用下，數(shù)量>1x104的骨髓MSCs與T淋巴細胞共培養(yǎng)4d后，與正常對照組相比，MSCs可顯著上調(diào)ITP患者及正常人T淋巴細胞中CD4+CD25+T淋巴細胞比例及CD4+CD25+/CD4+比值(P<0.05)，且隨MSCs量的增加，作用增強(P<0.05)。本研究未檢測到骨髓MSC

5、s本身分泌IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10。在PHA作用下，ITP患者T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2、IFN-γ較正常人高(P<0.05)，IL-4、IL-10較正常人低(P<0.05)。骨髓MSCs與T淋巴細胞共培養(yǎng)后，與對照組相比，MSCs可顯著抑制ITP患者或正常人T淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ(P<0.05)，且隨MSCs數(shù)量增加，抑制作用增強(P<0.05)，共培養(yǎng)4d、6d其抑制作用明顯強于2d(P<0.05)

6、；MSCs可促進ITP患者T淋巴細胞分泌IL-4、IL-10(P<0.05)，且隨MSCs數(shù)量增加，促進作用增強(P<0.05)；MSCs對IL-4的作用與培養(yǎng)時間無顯著相關性(P>0.05)，但對IL-10促進作用隨時間延長而增強(P<0.05)；當MSCs數(shù)量>1×104可促進正常人T淋巴細胞分泌IL-4(P<0.05)，且隨MSCs數(shù)量增加，促進作用增強(P<0.05)，共培養(yǎng)4d、6d作用明顯強于2d(P<0.05)；MSCs可

7、促進正常人T淋巴細胞分泌IL-10(P<0.05)，且隨MSCs數(shù)量增加，促進作用增強(P<0.05)，共培養(yǎng)4d、6d其促進作用明顯強于2d(P<0.05)。體外骨髓MSCs對ITP患者T淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10具有調(diào)控作用，同時對CD4+CD25+T淋巴細胞具有上調(diào)作用，以上這種機制可使ITP患者的細胞因子及CD4+CD25+T淋巴細胞逐漸接近于正常人但仍達不到正常人水平(P<0.05)。 結論