2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:
  炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是合并有多種腸外表現(xiàn)的消化道疾病的腸道炎癥性疾病,本病以反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥為主要的病理表現(xiàn),目前其發(fā)病的機(jī)制仍不完全明確。根據(jù)其病理和臨床表現(xiàn)的不同,醫(yī)學(xué)工作者將其分為三種:潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)、克羅恩病(Crohn's Disease,CD)、以及尚未明確類型的未定型IBD。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是成體干細(xì)胞

2、家族中的一員,并且最早經(jīng)人工分離出來,具有較低的基本不引起免疫反應(yīng)的免疫原性、向多種成體細(xì)胞分化的潛能同時還能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫失衡的作用等優(yōu)點,因此常常被用來體內(nèi)移植治療相關(guān)疾病,以IBD為例,因BMMSCs可以對發(fā)生充血水腫以及糜爛潰瘍的腸道黏膜進(jìn)行修復(fù)同時還能夠失機(jī)體及局部的失衡的免疫功能恢復(fù)平衡,而成為治療本病的首選細(xì)胞。然而,BMMSCs移植抑制炎癥進(jìn)展機(jī)制尚不明確。由于MAPK/NF-κB信號傳導(dǎo)通路與Th1/Th2免疫細(xì)胞相關(guān)

3、的免疫反應(yīng)密切相關(guān),且對IBD的發(fā)生與進(jìn)展發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)控MAPK/NF-κB信號通路靶點糾正實驗性IBD小鼠免疫失衡的機(jī)制具有重要的意義。
  研究目的:
  通過移植BMMSCs在治療實驗性IBD小鼠,進(jìn)一步檢測BMMSCs在小鼠模型中發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)作用,同時在篩查關(guān)鍵基因的基礎(chǔ)上探討B(tài)MMSCs如何通過MAPK/NF-κB信號通路靶點來發(fā)揮糾正實驗性IBD小鼠免疫失衡的具體機(jī)制,從而為

4、干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)支持。
  實驗內(nèi)容:
  1、構(gòu)建并鑒定BMMSCs。
  2、檢測BMMSCs在IBD小鼠體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用及篩查MAPK/NF-κB信號通路相關(guān)的差異基因
  3、在IBD小鼠體內(nèi)中正反驗證差異基因的調(diào)節(jié)機(jī)制
  研究方法:
  1、選用3天的BALB/c雄性乳鼠采用全骨髓加碎骨片法分離并體外培養(yǎng)BMMSCs從而獲得純度較高的BMMSCs。
  2、通過觀察BM

5、MSCs的細(xì)胞形態(tài)、對細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測以及誘導(dǎo)分化對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行檢測和鑒別。
  3、選擇6-8周齡左右的成年BALB/c雌性小鼠,隨機(jī)分為空白對照組、造模組和治療組:①對照組(C組):用生理鹽水給小鼠灌腸,每只0.1ml,灌腸后垂直1分鐘后放入飼養(yǎng)籠中,每7天灌腸一次,連續(xù)灌腸四次,最后一次灌腸后次日,通過尾靜脈注射0.1ml純PBS液體,n=30;②造模組(T組):用現(xiàn)配的灌腸劑(TNBS2.0mg/50%乙醇)給小鼠灌腸

6、,通過靜脈留置針軟管給予造模組每只小鼠0.1ml的灌腸劑,垂懸1分鐘后放入飼養(yǎng)籠中,每7天灌腸一次,連續(xù)灌腸四次,最后一次灌腸后的次日,通過尾靜脈注射0.1ml純的PBS液體,n=40;③治療組(M組):用TNBS2.0mg/50%乙醇灌腸劑給小鼠灌腸,每只0.1ml,垂直1分鐘后放入飼養(yǎng)籠中,每7天灌腸一次,連續(xù)灌腸四次,最后一次灌腸后第2天,通過尾靜脈注射0.1ml含有1×106個培養(yǎng)至第三代的純度較高的BMMSCs的PBS,n=4

7、0;
  4、觀察三組小鼠的精神、活躍度等一般狀況、體重變化等,并進(jìn)行臨床癥狀評分、肉眼及鏡下對腸道大體及組織學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行觀察和評估。
  5、分別于從當(dāng)日起,按照間隔兩日的時間規(guī)律,連續(xù)留取小鼠血液及組織學(xué)(腸道、脾臟)標(biāo)本,直至第十三天,所獲得的標(biāo)本經(jīng)處理后進(jìn)行保存。
  6、采用免疫組化檢測腸道上皮間的Occludin緊密連接蛋白和VEGF的表達(dá)情況。
  7、制備小鼠脾細(xì)胞單細(xì)胞懸液并利用流式細(xì)胞儀檢測Th

8、1/Th2細(xì)胞比例并利用QPCR和微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù)(CBA)檢測IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10細(xì)胞因子的表達(dá)。
  8、利用小鼠Roche NimbleGen基因表達(dá)12×135K芯片和全局信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)篩查分析差異基因。
  9、利用基因芯片以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)篩選出的有效差異基因MAPK13構(gòu)建其慢病毒載體和siRNA使增強(qiáng)抑制其表達(dá)。
  10、將轉(zhuǎn)染慢病毒和siRNA的BMMSCs移植入IB

9、D小鼠模型體內(nèi)進(jìn)行相關(guān)驗證。
  研究結(jié)果:
  1、采用骨髓加碎骨片法培養(yǎng)的BMMSCs鏡下觀察細(xì)胞成纖維狀形態(tài)均一,密集排列,細(xì)胞表面特異性抗原標(biāo)志物檢測顯示:陽性表達(dá)標(biāo)志物CD90.2;CD105;陰性表達(dá)標(biāo)志物CD45-;CD11b-;成骨誘導(dǎo)后鏡下可見明顯的骨結(jié)節(jié)形成,成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)后鏡下可見脂肪滴。
  2、TNBS2.0mg/50%乙醇灌腸法誘導(dǎo)后的實驗性IBD小鼠模型的一般狀態(tài)較差,死亡率提高,臨床癥狀

10、評分以及HE染色后的組織學(xué)評分較空白組小鼠出現(xiàn)上升的趨勢,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。取標(biāo)本后大體觀察可見腸壁明顯增厚并出現(xiàn)一定的短縮,局部腸段因慢性炎癥的累積形成纖維化而出現(xiàn)腸腔縮窄,腸黏膜出現(xiàn)輕重不一的充血、水腫,黏膜及黏膜下層有中性粒、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤,與空白對照組(C組)比較均出現(xiàn)差異(p<0.05);與造模組(T組)相比,治療組(M組)移植后第2天起,小鼠死亡率下降,DAI及HE染色后的組織病理學(xué)鏡下評分出現(xiàn)下降(p<0.05)

11、。
  3、BMMSCs移植后免疫細(xì)胞檢測結(jié)果提示:造模組(T組)小鼠Th1細(xì)胞比例是17.95%,治療后Th1細(xì)胞比例是12.18%,出現(xiàn)明顯的下調(diào),而造模組小鼠Th2細(xì)胞比例是0.88%,治療后Th2細(xì)胞比例是0.67%,沒有明顯的變化。
  4、BMMSCs移植后免疫因子檢測結(jié)果提示:與對照組(C組)相比,促炎因子IL-2、TNF-α水平在T組上升分別于第3天和第5天達(dá)到最高(p<0.01),而后逐漸下降。在M組中,促

12、炎因子IL-2、TNF-α水平均于治療后第3天開始逐漸下降(p<0.01)。與對照組(C組)相比,抑炎因子IL-10水平在T組中無明顯變化,M組中一直處于上升趨勢。
  5、將轉(zhuǎn)染MAPK13慢病毒和siRNA的BMMSCs分別移植入IBD小鼠模型進(jìn)行免疫細(xì)胞檢測:普通BMMSCs治療組(a組)小鼠Th1細(xì)胞比例是11.10%,MAPK13基因過表達(dá)的BMMSCs治療組(b組)小鼠Th1細(xì)胞比例是22.47%,MAPK13基因si

13、RNA干擾的BMMSCs組(c組)10.11%。而普通BMMSCs治療組(a組)小鼠Th2細(xì)胞比例是0.53%,MAPK13基因過表達(dá)的BMMSCs治療組(b組)小鼠Th2細(xì)胞比例是0.44%,MAPK13基因siRNA干擾的BMMSCs組(c組)2.82%。
  6、將轉(zhuǎn)染MAPK13慢病毒和siRNA的BMMSCs分別移植入IBD小鼠模型進(jìn)行免疫因子檢測:(1)與普通BMMSCs組(a組)相比,MAPK13基因過表達(dá)的BMMS

14、Cs組(b組)TNF-a水平于尾靜脈注射治療第1天上升不明顯,第3天時TNF-a水平達(dá)到最高(p<0.01);MAPK13-siRNA干擾的BMMSCs組(c組),TNF-a水平在移植后的三天內(nèi)呈現(xiàn)下降的趨勢。(2)與普通BMMSCs組(a組)相比,MAPK13基因過表達(dá)的BMMSCs組(b組)IL-2水平于尾靜脈移植治療后第1天開始上升,到移植后第3天時IL-2水平達(dá)到最高(p<0.01)。MAPK13基因siRNA干擾的BMMSCs

15、組(c組)IL-2炎癥在三天內(nèi)呈下降趨勢。(3)與普通BMMSCs組(a組)相比MAPK13基因過表達(dá)的BMMSCs組(b組)IL-10水平于尾靜脈注射治療第1-3天上升不明顯,抑炎因子IL-10水平?jīng)]有明顯的差異(p>0.05),而MAPK13基因siRNA干擾的BMMSCs組(c組)IL-10在移植后的三天內(nèi)呈現(xiàn)上升的趨勢,與普通BMMSCs相比有明顯的差異(p<0.01)。
  研究結(jié)論:
  1、BMMSCs移植可以

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