核因子-κB信號(hào)通路參與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖-凋亡調(diào)節(jié).pdf

1、目的:探討核因子κ B(Nuclear Factor—κ B,NF—κ B)信號(hào)通路是否參與調(diào)節(jié)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)的增殖及凋亡作用。
　　 材料和方法:(1)貼壁法獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞:取股骨頭置換或全髖關(guān)節(jié)置換患者股骨髓腔內(nèi)骨髓血混合物,通過(guò)差速貼壁法分離培養(yǎng)純化鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。(2)流式細(xì)胞術(shù)鑒定表面分子表達(dá):采用細(xì)胞表面分子標(biāo)志流

2、式抗體熒光染色后,用流式細(xì)胞方法檢測(cè)細(xì)胞表面分子表達(dá)。(3)應(yīng)用蛋白凝膠電泳(western blotting)的方法檢測(cè)藥物干預(yù)(激活劑脂多糖,Lipopolysaccharides,LPS；抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽,PDTC)后NF—κ B表達(dá)水平以及增殖、凋亡相關(guān)蛋白變化。(4)另用蛋白凝膠電泳分別檢測(cè)相關(guān)蛋白如PARP、PCNA等蛋白表達(dá)的變化。(5)細(xì)胞增殖檢測(cè):用MTT比色方法檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在LPS及PDTC的作用

3、下其增殖的變化。(6)細(xì)胞凋亡檢測(cè):通過(guò)將細(xì)胞標(biāo)記PI后進(jìn)行流式細(xì)胞分析檢測(cè)在NF—κ B信號(hào)通路激活后細(xì)胞凋亡變化。
　　 結(jié)果:(1)從手術(shù)中人股骨髓腔內(nèi)收集的骨髓能夠分離培養(yǎng)純化出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察,其形態(tài)學(xué)表現(xiàn)與間充質(zhì)干細(xì)胞外觀一致。(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示該細(xì)胞表面表達(dá)分子與間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)分子一致,證實(shí)本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)細(xì)胞即為間充質(zhì)干細(xì)胞。(3)向純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)分別及同時(shí)加入脂多糖(LPS,1ug/m

4、l)和吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC,25mM)后,在LPS作用下,NF-κ B通路中蛋白p65表達(dá)水平升高,提示NF—κ B通路激活。(4)其他相關(guān)蛋白表達(dá)也受到影響,增殖相關(guān)蛋白PCNA及凋亡相關(guān)蛋白PARP發(fā)生相關(guān)變化(經(jīng)統(tǒng)計(jì)P<0.05)。(5)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,hMSCs在LPS刺激下,細(xì)胞短期內(nèi)增殖受到刺激作用(經(jīng)統(tǒng)計(jì)P<0.05)。(6)流式細(xì)胞分析顯示,NF—κ B信號(hào)通路激活后,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡水平較正常降低,抑