骨髓間充質(zhì)干細胞對實驗性自身免疫性重癥肌無力的影響和機制.pdf

1、目的： 1.建立從Lewis大鼠骨髓中分離、培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的方法，并對分離、培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞進行鑒定。 　　2.研究鼠源乙酰膽堿受體α亞基97-116(Ra97-116)誘導(dǎo)實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)動物模型的可能性，為MG的基礎(chǔ)研究提供簡便實用的動物模型。 3.研究骨髓間充質(zhì)干細胞對實驗性自身免疫性重癥肌無力臨床和免疫功能的影響和機制，為MG的細胞移植治療提供實驗和理論依據(jù)。 方法：

2、 采用全骨髓培養(yǎng)法從Lewis大鼠骨髓中分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)細胞，經(jīng)貼壁法體外擴增、傳代和流式細胞儀鑒定MSCs。采用人工合成的Ra97-116肽段與完全弗氏佐劑(CFA)充分乳化后多點皮下注入6-8周齡雌性Lewis鼠，并在第30、60天強化注射與不完全弗氏佐劑(IFA)充分混合后的等量肽段構(gòu)建EAMG。對照組同期注入等量磷酸緩沖液(PBS)。通過觀察實驗鼠體重變化，并進行Lennon臨床評分；通過低頻重復(fù)電刺激檢查電衰減反應(yīng)和EL

3、JSA法檢測血清AchR-Ab滴度變化來確定EAMG是否成模。第三次免疫后一周后，將20只成模的EAMG鼠隨機分為移植治療組和EAMG對照組，分別給予MSCs 1×106/100gLPBS尾靜脈回輸，EAMG對照組給予1001μLPBS。自移植之日起，每日同一時間對移植組與EAMG對照組大鼠稱重和Lennon臨床評分。移植后第二周檢測兩組血清AehR-Ab，移植后第三周流式細胞儀檢測移植組、EAMG對照組以及同周齡健康Lewis大鼠CD

4、28、CTLA4、CD25在各組外周血CD4+T淋巴細胞中的表達。 結(jié)果： 1.原代培養(yǎng)的MSCs于24h后貼壁,48～72h形成集落，7～10d可達到70％～80％融合。第5代MSCs有97.5％表達CD90抗原，1.72％表達CD45抗原。 2.EAMG組中70％Lewis鼠Lennon臨床評分在1級以上，3、5Hz低頻重復(fù)電刺激陽性電衰減反應(yīng)D5>10％，血清AchR－Ab滴度與正常對照血清比值>2.1。

5、證實了實驗動物EAMG成模率達70％。 3.經(jīng)MSCs移植治療15天后，治療組EAMG大鼠體重較對照組大鼠明顯增加，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。 4.經(jīng)MSCs移植治療13天后，治療組EAMG臨床評分下降，與對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。 5.經(jīng)MSCs移植治療兩周后，治療組AChR-AbIgGOD值(0.884±0.32)明顯下降，與對照組(1.364±0.26)比較有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)

6、。 6.經(jīng)MSCs移植后第三周，治療組CD4+T淋巴細胞表面CD28表達已低于對照EAMG組(p<0.05)，并且與健康組無統(tǒng)計學(xué)意義的差別(p>0.05)，EAMG大鼠CD28表達較正常健康組有所上升(p<0.05)。治療組CD4+T淋巴細胞表面CTLA-4表達均顯著高于對照EAMG組和健康組P<0.01)，EAMG大鼠CTLA-4表達較正常健康組有所上升(p<0.05)。治療組CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細胞比率較對照EAMG組

7、和健康組顯著升高(p<0.01)，EAMG大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細胞較正常健康組無統(tǒng)計學(xué)意義上的差別(p>0.05)。 結(jié)論： 1.貼壁篩選培養(yǎng)法能夠成功分離、純化以及擴增得到細胞治療實驗所需要的MSCs。 2.用人工合成鼠源肽段R97-116免疫Lewis鼠可成功誘導(dǎo)EAMG模型，為MG的研究奠定了基礎(chǔ)。 3.MSCs移植可以有效地減輕EAMG的癥狀，降低AChR-Ab滴度，是一種簡便可行的干預(yù)方