姜黃素對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力的治療研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開論述：
　　第一部分 姜黃素對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力的治療研究
　　目的:
　　探討姜黃素對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　方法:
　　1.建立EAMG模型及臨床分級(jí)
　　選擇健康、SPF級(jí)別、雌性Lewis大鼠，一般6-8周齡，體重160-180 g。用H37Ra株熱滅活結(jié)核桿菌和不完全弗氏佐劑溶解人工合成的大鼠來源的AChR-α亞基97-116肽段合成

2、免疫乳劑，每只大鼠在雙后足墊皮下注射200μl乳劑，然后在免疫11天后于每只大鼠背部再次免疫1次，作為強(qiáng)化免疫。每間隔一天采用Lennon臨床評(píng)分量表對(duì)每只大鼠進(jìn)行臨床分級(jí)和稱重，直至發(fā)病高峰第45天，這個(gè)過程需要采用雙盲法。
　　2.EAMG大鼠的分組與治療
　　將18只Lewis大鼠每6只一組，隨機(jī)分成姜黃素小劑量治療組(50mg/kg)和姜黃素大劑量治療組(100mg/kg)和EAMG對(duì)照組（同體積PEG）。于EAMG

3、大鼠發(fā)病第11日起開始，隔日給予姜黃素及等體積的PEG腹腔注射，直至大鼠發(fā)病高峰期笫45天。
　　3.制備淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells，MNC)
　　在EAMG大鼠發(fā)病高峰期，無菌操作下分離、獲取各組大鼠腹股溝淋巴結(jié)，通過研磨過濾、離心，制備MNC懸液，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，通過計(jì)算，最終獲取細(xì)胞濃度為2×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞中的細(xì)胞因子
　

4、　取大鼠腹股溝淋巴結(jié)制備單細(xì)胞懸液，加入細(xì)胞刺激阻斷劑，培養(yǎng)4h后收集細(xì)胞，標(biāo)記CD4+IFN-γ+(Th1)、CD4+IL-4+(Th2)、CD4+ IL-17+(Th17)和CD4+Foxp3+(Treg)細(xì)胞，及細(xì)胞因子TNF-α、IL-10，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.姜黃素可緩解EAMG大鼠的癥狀
　　與未經(jīng)治療的EAMG對(duì)照組相比，姜黃素治療的EAMG大鼠臨床癥狀明顯緩解。與且EAMG對(duì)照組相比

5、，大劑量姜黃素組在發(fā)病后第23天，27天，29天，33天，35天，37天，39天，41天，43天和45天均明顯減輕了大鼠的臨床癥狀。小劑量姜黃素組在發(fā)病后第29天，31天，43天and45天與對(duì)照組相比明顯減輕了臨床癥狀。
　　2.姜黃素抑制EAMG大鼠淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞上CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達(dá)與EAMG對(duì)照組相比，大劑量姜黃素治療組中大鼠淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞上CD80及MHC-Ⅱ的表達(dá)均顯著降低。兩組姜黃素治療組的淋巴結(jié)

6、單個(gè)核細(xì)胞上CD86的表達(dá)與EAMG對(duì)照組相比均明顯降低。
　　3.姜黃素對(duì)EAMG大鼠淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞中細(xì)胞因子的影響
　　用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞中的CD4+IFN-γ+(Th1)細(xì)胞、CD4+IL-4+(Th2)細(xì)胞、CD4+IL-17+(Th17)細(xì)胞和CD4+Foxp3+(Treg)比例發(fā)現(xiàn)，姜黃素治療后Th1、Th2、Th17、Treg的細(xì)胞比例有明顯變化，抑制了疾病的免疫進(jìn)展。另外，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

7、各組淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞中IFN-γ、TNF-α、IL-10及1L-17細(xì)胞因子，與EAMG對(duì)照組相比，兩組姜黃素治療組大鼠MNC中的IFN-γ顯著降低，IL-10的表達(dá)明顯增加。小劑量姜黃素治療組與對(duì)照組相比，IL-17和TNF-α表達(dá)顯著下降;大劑量治療組的IL-17和TNF-α表達(dá)亦下降，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.姜黃素上調(diào)了淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞中NK細(xì)胞與NKT細(xì)胞的數(shù)量
　　姜黃素治療后，高劑量治療組的NK（CD3-CD

8、161a+）細(xì)胞的數(shù)量與EAMG對(duì)照組相比明顯升高。與對(duì)照組相比，兩組姜黃素治療后NKT(CD3+CD161a+)細(xì)胞數(shù)量顯著升高。
　　5.姜黃素的上調(diào)了淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞中B10細(xì)胞的數(shù)量
　　姜黃素治療后，與EAMG對(duì)照組相比，大劑量姜黃素治療組中B10(CD19+IL10+)細(xì)胞數(shù)量顯著升高，小劑量姜黃素治療組B10細(xì)胞亦升高，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　1.姜黃素治療有效緩解了EAMG大鼠的臨床癥

9、狀。
　　2.姜黃素治療抑制了EAMG大鼠T細(xì)胞表面共刺激因子CD80、CD86和MHCclass-Ⅱ的表達(dá)。
　　3.姜黃素治療抑制了促炎細(xì)胞因子IL-17、IFN-γ、TNF-α的產(chǎn)生，上調(diào)了抑炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，促進(jìn)Th細(xì)胞由Th1/Th17型向Th2/Treg型分化。
　　4.姜黃素治療增加了EAMG大鼠體內(nèi)NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞的數(shù)量。
　　5.姜黃素治療促進(jìn)B細(xì)胞分化為B10細(xì)胞。
　　6

10、.姜黃素治療增加了EAMG大鼠體內(nèi)保護(hù)性抗體IgG1的數(shù)量并且減少病理性抗體的總親和力。
　　第二部分 新型煙堿對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎的治療研究
　　目的:
　　我們給予EAN大鼠新型煙堿治療，并研究其對(duì)大鼠自身免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)新型煙堿可以改善EAN疾病的臨床癥狀，減少了坐骨神經(jīng)炎性細(xì)胞的浸潤，下調(diào)了細(xì)胞因子IL-10與IFN-γ的表達(dá)，上調(diào)了Treg細(xì)胞的表達(dá)，增加的NK細(xì)胞的數(shù)量。綜上結(jié)果表明，新型煙

11、堿有效的緩解了自身免疫性神經(jīng)炎模型大鼠的疾病癥狀，為治療格林-巴利綜合征提供了新選擇。
　　方法:
　　1.EAN模型的建立及臨床評(píng)分
　　從新鮮牛尾中提取抗原BPM，采用健康、SPF級(jí)別、6-8周雌性lewis大鼠，150-170g，將BPM溶于H37Ra株熱滅活結(jié)核桿菌和不完全弗氏佐劑中，充分混勻制備成免疫溶劑。大鼠雙后足墊皮下注射免疫溶劑造模，每只大鼠用量為200μl。注射當(dāng)天定為第0天，雙盲法臨床評(píng)分，每日稱重

12、，直至發(fā)病高峰第16天。
　　2.動(dòng)物分組及藥物干預(yù)
　　將15只大鼠隨機(jī)分為三組，每組5只且體重平均數(shù)基本一致。三組分別為小劑量治療組(2 mg/kg)、大劑量治療組(20 mg/kg)和EAN對(duì)照組（同體積蒸餾水）。治療組于免疫后5第天開始用灌胃法給予新型煙堿藥物治療，直至免疫后第16天。對(duì)照組灌胃給予相同體積的蒸餾水。
　　3.組織病理學(xué)檢測(cè)
　　在發(fā)病高峰期水合氯醛麻醉后脫臼處死大鼠，取坐骨神經(jīng)置于10％

13、多聚甲醛中固定，石蠟包埋后常規(guī)切片，然后依次經(jīng)脫蠟、水化、蘇木素染色、0.5％伊紅液染色、脫水、透明、封片等步驟處理。顯微鏡下觀察坐骨神經(jīng)中炎性細(xì)胞的浸潤情況，并計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。
　　4.制備淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells，MNC)
　　無菌操作下分離大鼠腹股溝淋巴結(jié)，用玻璃棒研磨、細(xì)胞濾器過濾、離心后制備單個(gè)核細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后調(diào)整獲得細(xì)胞濃度為2×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。
　　5.流式

14、檢測(cè)Treg細(xì)胞的比例
　　取調(diào)整好濃度的淋巴結(jié)MNC懸液，加入標(biāo)記的CD25抗體和CD4抗體，孵育30min后加入固定破膜工作液，避光孵育過夜，次日后洗滌細(xì)胞加入PE-cy5標(biāo)記的Foxp3抗體靜置30min后，重懸過濾細(xì)胞后上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.三組大鼠的發(fā)病癥狀與臨床評(píng)分
　　三組老鼠均在第16天達(dá)到發(fā)病高峰，與對(duì)照組相比，兩組新型煙堿治療組大鼠的臨床癥狀明顯改善.與對(duì)照組相比，大劑量煙

15、堿治療組的臨床評(píng)分從免疫后的第11天到16天均顯著降低。小劑量煙堿治療組的臨床評(píng)分也有降低，在免疫后第11天、第14天、第15天、第16天與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組治療組間評(píng)分無明顯差異。
　　2.新型煙堿治療減少了EAN大鼠坐骨神經(jīng)中炎性細(xì)胞浸潤的情況與EAN對(duì)照組相比，大劑量煙堿治療組(20mg/kg)和小劑量煙堿治療組(2mg/kg)大鼠坐骨神經(jīng)均可見炎性細(xì)胞浸潤減少，且大劑量治療組與小劑量治療組相比可見更少的炎性細(xì)胞

16、浸潤。
　　3.新型煙堿抑制了EAN大鼠IL-10、IFN-γ的表達(dá)
　　用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞中的IL-10、IFN-γ、IL-17細(xì)胞因子的表達(dá)。與EAN對(duì)照組相比，兩組新型煙堿治療組的IL-10表達(dá)均下降，大劑量新型煙堿治療后細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)明顯下降，小劑量組IFN-γ表達(dá)亦下降但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組新型煙堿治療后IL-17表達(dá)均下降，但與對(duì)照組相比沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.新型煙堿治療上

17、調(diào)了淋巴結(jié)MNC中Treg細(xì)胞的表達(dá)
　　用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞中Treg細(xì)胞的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與EAN對(duì)照組相比，大劑量煙堿治療組上調(diào)了CD4+Foxp3+細(xì)胞的數(shù)量，小劑量煙堿治療組中CD4+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量亦上升，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5.新型煙堿治療的增加了MNC中NK細(xì)胞的數(shù)量
　　用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞中NK細(xì)胞的表達(dá)情況。與EAN對(duì)照組相比，大劑量新型煙堿治療組CD3

18、-CD161a+(NK)細(xì)胞數(shù)量增加，小劑量煙堿治療組中NK細(xì)胞有升高趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　本研究發(fā)現(xiàn)，給予EAN大鼠新型煙堿治療后可有效緩解大鼠的臨床癥狀，藥物通過抑制坐骨神經(jīng)炎性細(xì)胞的浸潤，降低淋巴結(jié)MNC的CD80的表達(dá)，上調(diào)淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞中Treg細(xì)胞的數(shù)量，抑制IL-10與IFN-γ細(xì)胞因子的表達(dá)，增加的NK細(xì)胞數(shù)量幾個(gè)方面發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)為臨床上治療人類GBS提供了一種新策略和新方